Диференцијалната дијагноза на белодробни нодули идентификувани со компјутеризирана томографија (КТ) останува предизвик во клиничката пракса. Овде, го карактеризираме глобалниот метаболом на 480 серумски примероци, вклучувајќи здрави контроли, бенигни белодробни нодули и белодробен аденокарцином во стадиум I. Аденокарциномите покажуваат уникатни метаболомски профили, додека бенигните нодули и здравите лица имаат голема сличност во метаболомските профили. Во групата на откривање (n = 306), идентификуван е сет од 27 метаболити за да се направи разлика помеѓу бенигни и малигни нодули. AUC на дискриминантниот модел во групите за внатрешна валидација (n = 104) и надворешна валидација (n = 111) беше 0,915 и 0,945, соодветно. Анализата на патеките откри зголемени гликолитички метаболити поврзани со намален триптофан во серумот на белодробен аденокарцином во споредба со бенигните нодули и здравите контроли, и сугерираше дека внесувањето на триптофан ја промовира гликолизата во клетките на ракот на белите дробови. Нашата студија ја истакнува вредноста на биомаркерите на серумските метаболити во проценката на ризикот од белодробни нодули откриени со КТ.
Раната дијагноза е клучна за подобрување на стапките на преживување кај пациентите со рак. Резултатите од Националното испитување за скрининг на рак на белите дробови во САД (NLST) и Европската студија NELSON покажаа дека скринингот со компјутеризирана томографија со ниска доза (LDCT) може значително да ја намали смртноста од рак на белите дробови кај групите со висок ризик1,2,3. Од широката употреба на LDCT за скрининг на рак на белите дробови, инциденцата на инцидентни радиографски наоди на асимптоматски белодробни нодули продолжи да се зголемува4. Белодробните нодули се дефинираат како фокални непроѕирности до 3 cm во дијаметар5. Се соочуваме со тешкотии во проценката на веројатноста за малигнитет и справувањето со големиот број белодробни нодули откриени случајно на LDCT. Ограничувањата на CT може да доведат до чести контролни прегледи и лажно позитивни резултати, што доведува до непотребна интервенција и прекумерен третман6. Затоа, постои потреба да се развијат сигурни и корисни биомаркери за правилно идентификување на ракот на белите дробови во раните фази и диференцирање на повеќето бенигни нодули при почетно откривање7.
Сеопфатната молекуларна анализа на крвта (серум, плазма, мононуклеарни клетки од периферна крв), вклучувајќи геномика, протеомика или метилација на ДНК8,9,10, доведе до зголемен интерес за откривање на дијагностички биомаркери за рак на белите дробови. Во меѓувреме, метаболомичките пристапи ги мерат клеточните крајни производи кои се под влијание на ендогени и егзогени дејства и затоа се применуваат за предвидување на почетокот и исходот на болеста. Течната хроматографија-тандем масена спектрометрија (LC-MS) е широко користен метод за метаболомички студии поради неговата висока чувствителност и голем динамички опсег, кој може да опфати метаболити со различни физичкохемиски својства11,12,13. Иако глобалната метаболомичка анализа на плазма/серум е користена за идентификување на биомаркери поврзани со дијагнозата на рак на белите дробови14,15,16,17 и ефикасноста на третманот,18 класификаторите на серумските метаболити за разликување помеѓу бенигни и малигни белодробни нодули сè уште треба многу да се изучуваат. -масивно истражување.
Аденокарциномот и сквамозноклеточниот карцином се двата главни подтипови на неситноклеточен карцином на белите дробови (NSCLC). Различни скрининг тестови со КТ покажуваат дека аденокарциномот е најчестиот хистолошки тип на карцином на белите дробови1,19,20,21. Во оваа студија, користевме ултра-перформансна течна хроматографија-масена спектрометрија со висока резолуција (UPLC-HRMS) за да извршиме метаболомичка анализа на вкупно 695 серумски примероци, вклучувајќи здрави контроли, бенигни белодробни нодули и КТ-откриени ≤3 cm. Скрининг за белодробен аденокарцином во стадиум I. Идентификувавме панел на серумски метаболити кои го разликуваат белодробниот аденокарцином од бенигни нодули и здрави контроли. Анализата за збогатување на патеките покажа дека абнормалниот метаболизам на триптофан и гликоза се чести промени кај белодробниот аденокарцином во споредба со бенигните нодули и здравите контроли. Конечно, воспоставивме и валидиравме серумски метаболички класификатор со висока специфичност и чувствителност за да се направи разлика помеѓу малигни и бенигни белодробни нодули откриени со LDCT, што може да помогне во раната диференцијална дијагноза и проценка на ризикот.
Во тековната студија, ретроспективно беа собрани примероци од серум со совпаѓање на полот и возраста од 174 здрави контроли, 292 пациенти со бенигни белодробни нодули и 229 пациенти со аденокарцином на белите дробови во стадиум I. Демографските карактеристики на 695 испитаници се прикажани во Дополнителната табела 1.
Како што е прикажано на Слика 1а, вкупно 480 серумски примероци, вклучувајќи 174 здрави контролни (HC), 170 бенигни нодули (BN) и 136 примероци од аденокарцином на белите дробови (LA) во стадиум I, беа собрани во Универзитетскиот центар за рак Сун Јат-сен. Кохорта за откривање на нецелно метаболомско профилирање со употреба на ултра-перформансна течна хроматографија-масена спектрометрија со висока резолуција (UPLC-HRMS). Како што е прикажано на Дополнителната слика 1, беа идентификувани диференцијални метаболити помеѓу LA и HC, LA и BN за да се воспостави модел на класификација и понатамошно истражување на анализата на диференцијалните патеки. 104 примероци собрани од Универзитетскиот центар за рак Сун Јат-сен и 111 примероци собрани од две други болници беа подложени на внатрешна и надворешна валидација, соодветно.
a Студиска популација во кохортата за откривање која била подложена на глобална серумска метаболомичка анализа со употреба на ултра-перформансна течна хроматографија-масена спектрометрија со висока резолуција (UPLC-HRMS). b Делумна дискриминантна анализа на најмали квадрати (PLS-DA) на вкупниот метаболом од 480 серумски примероци од студиската кохорта, вклучувајќи здрави контроли (HC, n = 174), бенигни нодули (BN, n = 170) и аденокарцином на белите дробови во стадиум I (Лос Анџелес, n = 136). +ESI, позитивен режим на јонизација со електроспреј, -ESI, негативен режим на јонизација со електроспреј. c–e Метаболитите со значително различни изобилства во две дадени групи (двостран Wilcoxon-ов знаковен ранг тест, p вредност прилагодена на стапката на лажно откривање, FDR <0,05) се прикажани со црвена боја (промена на превиткување > 1,2) и сина боја (промена на превиткување < 0,83). ) прикажани на графиконот на вулканот. f Хиерархиска мапа на топлина за групирање што покажува значајни разлики во бројот на анотирани метаболити помеѓу LA и BN. Изворните податоци се обезбедени во форма на датотеки со изворни податоци.
Вкупниот серумски метаболом на 174 HC, 170 BN и 136 LA во групата на откривање беше анализиран со помош на UPLC-HRMS анализа. Прво покажуваме дека примероците за контрола на квалитетот (QC) се групираат цврсто во центарот на моделот на ненадгледувана анализа на главните компоненти (PCA), потврдувајќи ја стабилноста на перформансите на тековната студија (Дополнителна слика 2).
Како што е прикажано во делумната дискриминантна анализа со метод на најмали квадрати (PLS-DA) на Слика 1 б, откривме дека постојат јасни разлики помеѓу LA и BN, LA и HC во позитивни (+ESI) и негативни (-ESI) режими на електроспреј јонизација. Сепак, не се пронајдени значајни разлики помеѓу BN и HC во +ESI и -ESI услови.
Пронајдовме 382 диференцијални карактеристики помеѓу LA и HC, 231 диференцијални карактеристики помеѓу LA и BN и 95 диференцијални карактеристики помеѓу BN и HC (Wilcoxon тест со знаковен ранг, FDR <0,05 и повеќекратна промена >1,2 или <0,83) (Слика .1c-e). . Врвовите беа дополнително анотирани (Дополнителни податоци 3) во однос на базата на податоци (библиотека mzCloud/HMDB/Chemspider) преку m/z вредност, време на задржување и пребарување на фрагментациски масен спектар (детали опишани во делот Методи) 22. Конечно, 33 и 38 анотирани метаболити со значајни разлики во изобилството беа идентификувани за LA наспроти BN (Слика 1f и Дополнителна табела 2) и LA наспроти HC (Дополнителна слика 3 и Дополнителна табела 2), соодветно. Спротивно на тоа, само 3 метаболити со значајни разлики во изобилството беа идентификувани во BN и HC (Дополнителна табела 2), што е во согласност со преклопувањето помеѓу BN и HC во PLS-DA. Овие диференцијални метаболити опфаќаат широк спектар на биохемикалии (Дополнителна слика 4). Земени заедно, овие резултати покажуваат значајни промени во серумскиот метаболом што одразуваат малигна трансформација на рак на белите дробови во рана фаза во споредба со бенигни белодробни нодули или здрави лица. Во меѓувреме, сличноста на серумскиот метаболом на BN и HC сугерира дека бенигните белодробни нодули може да делат многу биолошки карактеристики со здрави лица. Со оглед на тоа што мутациите на генот на рецепторот на епидермалниот фактор на раст (EGFR) се чести кај белодробниот аденокарцином подтип 23, се обидовме да го утврдиме влијанието на двигателските мутации врз серумскиот метаболом. Потоа го анализиравме целокупниот метаболомски профил на 72 случаи со статус на EGFR во групата со белодробен аденокарцином. Интересно е што пронајдовме споредливи профили помеѓу пациенти со мутант на EGFR (n = 41) и пациенти со див тип на EGFR (n = 31) во PCA анализата (Дополнителна слика 5а). Сепак, идентификувавме 7 метаболити чие изобилство беше значително изменето кај пациенти со мутација на EGFR во споредба со пациенти со EGFR од див тип (t тест, p < 0,05 и промена на преклоп > 1,2 или < 0,83) (Дополнителна слика 5б). Поголемиот дел од овие метаболити (5 од 7) се ацилкарнитини, кои играат важна улога во патиштата на оксидација на масни киселини.
Како што е илустрирано во работниот тек прикажан на Слика 2 а, биомаркерите за класификација на нодули се добиени со користење на оператори за најмалку апсолутно намалување и селекција врз основа на 33 диференцијални метаболити идентификувани во LA (n = 136) и BN (n = 170). Најдобра комбинација на варијабли (LASSO) – модел на бинарна логистичка регресија. Десеткратна вкрстена валидација е користена за тестирање на веродостојноста на моделот. Селекцијата на варијабли и регуларизацијата на параметрите се прилагодени со казна за максимизација на веројатноста со параметар λ24. Глобалната метаболомичка анализа е дополнително извршена независно во групите за внатрешна валидација (n = 104) и надворешна валидација (n = 111) за да се тестираат перформансите на класификацијата на дискриминантниот модел. Како резултат на тоа, 27 метаболити во сетот откритија се идентификувани како најдобар дискриминантен модел со најголема средна вредност на AUC (Сл. 2б), меѓу кои 9 имале зголемена активност, а 18 намалена активност во LA во споредба со BN (Сл. 2в).
Работен тек за изградба на класификатор на пулмонални нодули, вклучувајќи избор на најдобар панел на серумски метаболити во сетот за откривање со користење на бинарен логистички регресивен модел преку десеткратна вкрстена валидација и евалуација на предикативните перформанси во сетови за внатрешна и надворешна валидација. b Статистика за вкрстена валидација на LASSO регресивниот модел за избор на метаболички биомаркери. Броевите дадени погоре го претставуваат просечниот број на биомаркери избрани при даден λ. Црвената испрекината линија ја претставува просечната вредност на AUC при соодветната ламбда. Сивите ленти за грешка ги претставуваат минималните и максималните вредности на AUC. Испрекинатата линија го означува најдобриот модел со 27 избрани биомаркери. AUC, површина под кривата на оперативните карактеристики на приемникот (ROC). c Промени на преклопување на 27 избрани метаболити во групата LA во споредба со групата BN во групата за откривање. Црвена колона - активирање. Сината колона е опаѓање. d–f Криви на оперативните карактеристики на приемникот (ROC) што ја покажуваат моќноста на дискриминантниот модел врз основа на 27 комбинации на метаболити во сетови за откривање, внатрешна и надворешна валидација. Изворните податоци се дадени во форма на датотеки со изворни податоци.
Создаден е модел за предвидување врз основа на пондерираните коефициенти на регресија на овие 27 метаболити (Дополнителна табела 3). ROC анализата врз основа на овие 27 метаболити даде вредност на површината под кривата (AUC) од 0,933, чувствителноста на групата за откривање беше 0,868, а специфичноста беше 0,859 (Сл. 2d). Во меѓувреме, меѓу 38-те анотирани диференцијални метаболити помеѓу LA и HC, сет од 16 метаболити постигна AUC од 0,902 со чувствителност од 0,801 и специфичност од 0,856 во разликувањето на LA од HC (Дополнителна слика 6a-c). Исто така, беа споредени и вредностите на AUC врз основа на различни прагови на промена на превиткувањето за диференцијалните метаболити. Откривме дека моделот за класификација најдобро се покажа во разликувањето помеѓу LA и BN (HC) кога нивото на промена на превиткувањето беше поставено на 1,2 наспроти 1,5 или 2,0 (Дополнителна слика 7a,b). Моделот за класификација, базиран на 27 групи метаболити, беше дополнително валидиран во внатрешни и надворешни кохорти. AUC беше 0,915 (сензитивност 0,867, специфичност 0,811) за внатрешна валидација и 0,945 (сензитивност 0,810, специфичност 0,979) за надворешна валидација (Сл. 2e, f). За да се процени меѓулабораториската ефикасност, 40 примероци од надворешната кохорта беа анализирани во надворешна лабораторија како што е опишано во делот Методи. Точноста на класификацијата постигна AUC од 0,925 (Дополнителна слика 8). Бидејќи сквамозен карцином на белите дробови (LUSC) е втор најчест подтип на неситноклеточен карцином на белите дробови (NSCLC) по аденокарцином на белите дробови (LUAD), ја тестиравме и валидираната потенцијална корисност на метаболичките профили. BN и 16 случаи на LUSC. AUC на разликување помеѓу LUSC и BN беше 0,776 (Дополнителна слика 9), што укажува на послаба способност во споредба со разликувањето помеѓу LUAD и BN.
Студиите покажаа дека големината на нодулите на КТ сликите е позитивно корелирана со веројатноста за малигнитет и останува главен детерминант за третман на нодули25,26,27. Анализата на податоците од големата кохорта на скрининг студијата NELSON покажа дека ризикот од малигнитет кај испитаници со лимфни јазли <5 mm е дури и сличен на оној кај испитаници без лимфни јазли28. Затоа, минималната големина што бара редовно КТ мониторирање е 5 mm, како што препорачува Британското торакално друштво (BTS), и 6 mm, како што препорачува Флејшнерското друштво29. Сепак, нодулите поголеми од 6 mm и без очигледни бенигни карактеристики, наречени неопределени пулмонални нодули (IPN), остануваат голем предизвик во евалуацијата и управувањето во клиничката пракса30,31. Потоа испитавме дали големината на нодулите влијаела врз метаболомските потписи користејќи збирни примероци од кохортите за откривање и интерна валидација. Фокусирајќи се на 27 валидирани биомаркери, прво ги споредивме PCA профилите на HC и BN метаболоми под 6 mm. Откривме дека повеќето од точките на податоци за HC и BN се преклопуваат, покажувајќи дека нивоата на серумските метаболити се слични во обете групи (Сл. 3а). Мапите на карактеристиките низ различни опсези на големина останаа зачувани кај BN и LA (Сл. 3б, в), додека беше забележана поделба помеѓу малигните и бенигните нодули во опсег од 6-20 mm (Сл. 3д). Оваа кохорта имаше AUC од 0,927, специфичност од 0,868 и чувствителност од 0,820 за предвидување на малигнитетот на нодулите со димензии од 6 до 20 mm (Сл. 3д, ѓ). Нашите резултати покажуваат дека класификаторот може да ги опфати метаболичките промени предизвикани од рана малигна трансформација, без оглед на големината на нодулите.
ad Споредба на PCA профилите помеѓу одредени групи врз основа на метаболички класификатор од 27 метаболити. CC и BN < 6 mm. b BN < 6 mm наспроти BN 6–20 mm. во LA 6–20 mm наспроти LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm и LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Крива на карактеристиките на работењето на приемникот (ROC) што ги покажува перформансите на дискриминантниот модел за нодули 6–20 mm. f Вредностите на веројатноста се пресметани врз основа на моделот на логистичка регресија за нодули со димензии 6–20 mm. Сивата испрекината линија ја претставува оптималната гранична вредност (0,455). Горенаведените броеви го претставуваат процентот на случаи проектирани за Лос Анџелес. Користете двостран Студентов t-тест. PCA, анализа на главни компоненти. AUC површина под кривата. Изворните податоци се дадени во форма на датотеки со изворни податоци.
Четири примероци (на возраст од 44–61 години) со слични големини на пулмоналните нодули (7–9 mm) беа дополнително избрани за да се илустрираат перформансите на предложениот модел за предвидување на малигнитет (Сл. 4a, b). При почетниот скрининг, Случајот 1 се претстави како цврст нодул со калцификација, карактеристика поврзана со бенигност, додека Случајот 2 се претстави како неопределен делумно цврст нодул без очигледни бенигни карактеристики. Три рунди на следење на КТ скенирањата покажаа дека овие случаи останале стабилни во период од 4 години и затоа се сметале за бенигни нодули (Сл. 4a). Во споредба со клиничката евалуација на сериските КТ скенирања, анализата на серумските метаболити со еден удар со тековниот класификаторски модел брзо и правилно ги идентификуваше овие бенигни нодули врз основа на веројатносни ограничувања (Табела 1). Слика 4б во случајот 3 покажува нодул со знаци на плеврална ретракција, што најчесто се поврзува со малигнитет32. Случајот 4 се претстави како неопределен делумно цврст нодул без докази за бенигна причина. Сите овие случаи беа предвидени како малигни според моделот на класификатор (Табела 1). Проценката на аденокарцином на белите дробови беше демонстрирана со хистопатолошко испитување по операција на ресекција на белите дробови (Сл. 4б). За надворешниот сет за валидација, метаболичкиот класификатор точно предвиде два случаи на неопределени белодробни нодули поголеми од 6 mm (Дополнителна слика 10).
КТ слики од аксијалниот прозорец на белите дробови кај два случаи на бенигни нодули. Во случај 1, КТ скенирањето по 4 години покажа стабилен цврст нодул со димензии 7 mm со калцификација во десниот долен лобус. Во случај 2, КТ скенирањето по 5 години откри стабилен, делумно цврст нодул со дијаметар од 7 mm во десниот горен лобус. б Аксијален прозорец КТ слики на белите дробови и соодветни патолошки студии на два случаи на аденокарцином во стадиум I пред ресекција на белите дробови. Случај 3 откри нодул со дијаметар од 8 mm во десниот горен лобус со плеврална ретракција. Случај 4 откри делумно цврст нодул во форма на стаклесто стакло со димензии 9 mm во левиот горен лобус. Боење со хематоксилин и еозин (H&E) на ресецирано белодробно ткиво (скала = 50 μm) што го демонстрира моделот на ацинусен раст на белодробниот аденокарцином. Стрелките означуваат нодули откриени на КТ слики. H&E сликите се репрезентативни слики од повеќе (>3) микроскопски полиња испитани од патологот.
Земени заедно, нашите резултати ја покажуваат потенцијалната вредност на биомаркерите на серумските метаболити во диференцијалната дијагноза на пулмоналните нодули, што може да претставува предизвик при евалуација на КТ скринингот.
Врз основа на валидиран панел на диференцијални метаболити, се обидовме да идентификуваме биолошки корелати на главните метаболички промени. Анализата за збогатување на KEGG патеките од страна на MetaboAnalyst идентификуваше 6 заеднички значително изменети патеки помеѓу двете дадени групи (LA наспроти HC и LA наспроти BN, прилагоден p ≤ 0,001, ефект > 0,01). Овие промени беа карактеризирани со нарушувања во метаболизмот на пируват, метаболизмот на триптофан, метаболизмот на ниацин и никотинамид, гликолизата, циклусот на TCA и метаболизмот на пурин (Сл. 5а). Потоа дополнително спроведовме целна метаболомика за да ги потврдиме главните промени користејќи апсолутна квантификација. Одредување на заеднички метаболити во најчесто изменети патеки со тројна квадрополна масена спектрометрија (QQQ) користејќи автентични стандарди на метаболити. Демографските карактеристики на целниот примерок од студијата за метаболомија се вклучени во Дополнителната табела 4. Во согласност со нашите глобални резултати од метаболомијата, квантитативната анализа потврди дека хипоксантинот и ксантинот, пируватот и лактатот се зголемени во LA во споредба со BN и HC (Сл. 5б, в, p <0,05). Сепак, не се пронајдени значајни разлики кај овие метаболити помеѓу BN и HC.
Анализа на збогатување на KEGG патеката на значително различни метаболити во LA групата во споредба со BN и HC групите. Користен е двостран Globaltest, а p вредностите беа прилагодени со користење на методот Holm-Bonferroni (прилагодено p ≤ 0,001 и големина на ефектот > 0,01). b–d Виолински дијаграми кои ги прикажуваат нивоата на хипоксантин, ксантин, лактат, пируват и триптофан во серумските HC, BN и LA определени со LC-MS/MS (n = 70 по група). Белите и црните испрекинати линии ја означуваат медијаната и квартилот, соодветно. e Виолински дијаграм кој ја прикажува нормализираната Log2TPM (транскрипти на милион) mRNA експресија на SLC7A5 и QPRT кај аденокарцином на белите дробови (n = 513) во споредба со нормалното белодробно ткиво (n = 59) во базата на податоци LUAD-TCGA. Белата кутија го претставува интерквартилниот опсег, хоризонталната црна линија во центарот ја претставува медијаната, а вертикалната црна линија што се протега од кутијата го претставува интервалот на доверба од 95% (CI). f Пирсонов корелациски графикон на експресијата на SLC7A5 и GAPDH кај аденокарцином на белите дробови (n = 513) и нормално белодробно ткиво (n = 59) во TCGA базата на податоци. Сивата област го претставува CI од 95%. r, Пирсонов коефициент на корелација. g Нормализирани клеточни нивоа на триптофан во клетките A549 трансфектирани со неспецифична shRNA контрола (NC) и shSLC7A5 (Sh1, Sh2) определени со LC-MS/MS. Презентирана е статистичка анализа на пет биолошки независни примероци во секоја група. h Клеточни нивоа на NADt (вкупен NAD, вклучувајќи NAD+ и NADH) во клетките A549 (NC) и клетките A549 со нокаут на SLC7A5 (Sh1, Sh2). Презентирана е статистичка анализа на три биолошки независни примероци во секоја група. i Гликолитичката активност на клетките A549 пред и по нокаутирањето на SLC7A5 беше измерена со стапка на екстрацелуларна ацидификација (ECAR) (n = 4 биолошки независни примероци по група). 2-DG,2-деокси-D-глукоза. Двостраниот Студентов t-тест беше користен во (b–h). Во (g–i), лентите за грешка ја претставуваат средната вредност ± SD, секој експеримент беше извршен три пати независно и резултатите беа слични. Изворните податоци се дадени во форма на датотеки со изворни податоци.
Со оглед на значајното влијание на променетиот метаболизам на триптофанот во групата LA, ги проценивме и нивоата на серумски триптофан во групите HC, BN и LA користејќи QQQ. Откривме дека серумскиот триптофан е намален во LA во споредба со HC или BN (p < 0,001, Слика 5d), што е во согласност со претходните наоди дека нивоата на циркулирачки триптофан се пониски кај пациенти со рак на белите дробови отколку кај здрави контроли од контролната група33,34,35. Друга студија со употреба на PET/CT трасер 11C-метил-L-триптофан откри дека времето на задржување на сигналот на триптофан во ткивото на ракот на белите дробови е значително зголемено во споредба со бенигните лезии или нормалното ткиво36. Претпоставуваме дека намалувањето на триптофанот во серумот на LA може да го одразува активното внесување на триптофан од страна на клетките на ракот на белите дробови.
Исто така е познато дека крајниот производ од кинуренинскиот пат на катаболизмот на триптофанот е NAD+37,38, што е важен супстрат за реакцијата на глицералдехид-3-фосфат со 1,3-бисфосфоглицерат во гликолизата39. Додека претходните студии се фокусираа на улогата на катаболизмот на триптофанот во имунолошката регулација, ние се обидовме да ја разјасниме интеракцијата помеѓу дисрегулацијата на триптофанот и гликолитичките патишта забележани во оваа студија. Член 5 од семејството транспортери на растворени супстанции 7 (SLC7A5) е познато дека е транспортер на триптофан43,44,45. Фосфорибозилтрансферазата на кинолинска киселина (QPRT) е ензим лоциран низводно од кинуренинскиот пат кој ја претвора кинолинската киселина во NAMN46. Инспекцијата на базата на податоци LUAD TCGA покажа дека и SLC7A5 и QPRT беа значително зголемени во туморското ткиво во споредба со нормалното ткиво (Сл. 5e). Ова зголемување е забележано во фазите I и II, како и во фазите III и IV на аденокарцином на белите дробови (Дополнителна слика 11), што укажува на рани нарушувања во метаболизмот на триптофанот поврзани со туморогенезата.
Дополнително, збирот на податоци LUAD-TCGA покажа позитивна корелација помеѓу експресијата на SLC7A5 и GAPDH mRNA во примероци од пациенти со рак (r = 0,45, p = 1,55E-26, Слика 5f). Спротивно на тоа, не е пронајдена значајна корелација помеѓу таквите генски потписи во нормалното белодробно ткиво (r = 0,25, p = 0,06, Слика 5f). Нокаудирањето на SLC7A5 (Дополнителна слика 12) во клетките A549 значително ги намали клеточните нивоа на триптофан и NAD(H) (Слика 5g,h), што резултира со намалена гликолитичка активност мерена со стапка на екстрацелуларна ацидификација (ECAR) (Слика 1). 5i). Така, врз основа на метаболички промени во серумот и ин витро детекција, претпоставуваме дека метаболизмот на триптофанот може да произведе NAD+ преку кинуренинскиот пат и да игра важна улога во промовирањето на гликолизата кај ракот на белите дробови.
Студиите покажаа дека голем број неопределени белодробни нодули откриени со LDCT може да доведат до потреба од дополнително тестирање како што се PET-CT, биопсија на белите дробови и прекумерен третман поради лажно позитивна дијагноза на малигнитет.31 Како што е прикажано на Слика 6, нашата студија идентификуваше панел на серумски метаболити со потенцијална дијагностичка вредност што може да ја подобри стратификацијата на ризикот и последователното управување со белодробните нодули откриени со CT.
Пулмоналните нодули се проценуваат со помош на компјутеризирана томографија со ниска доза (LDCT) со карактеристики на снимање кои сугерираат бенигни или малигни причини. Неизвесниот исход на нодулите може да доведе до чести контролни прегледи, непотребни интервенции и прекумерен третман. Вклучувањето на класификатори на серумски метаболизам со дијагностичка вредност може да ја подобри проценката на ризикот и последователното управување со пулмоналните нодули. PET позитронска емисиона томографија.
Податоците од студијата NLST во САД и студијата NELSON во Европа сугерираат дека скринингот на групи со висок ризик со компјутеризирана томографија со ниска доза (LDCT) може да ја намали смртноста од рак на белите дробови1,3. Сепак, проценката на ризикот и последователното клиничко управување со голем број инцидентни белодробни нодули откриени со LDCT остануваат најпредизвикувачки. Главната цел е да се оптимизира правилната класификација на постојните протоколи базирани на LDCT со вклучување на сигурни биомаркери.
Одредени молекуларни биомаркери, како што се метаболитите во крвта, се идентификувани со споредување на ракот на белите дробови со здрави контроли15,17. Во оваа студија, се фокусиравме на примена на анализа на серумската метаболомика за да се направи разлика помеѓу бенигни и малигни белодробни нодули случајно откриени со LDCT. Го споредивме глобалниот серумски метаболом на примероци од здрава контролна (HC), бенигни белодробни нодули (BN) и стадиум I на белодробен аденокарцином (LA) користејќи UPLC-HRMS анализа. Откривме дека HC и BN имаат слични метаболички профили, додека LA покажа значајни промени во споредба со HC и BN. Идентификувавме два сета серумски метаболити кои го разликуваат LA од HC и BN.
Тековната шема за идентификација на бенигни и малигни нодули базирана на LDCT главно се базира на големината, густината, морфологијата и стапката на раст на нодулите со текот на времето30. Претходните студии покажаа дека големината на нодулите е тесно поврзана со веројатноста за рак на белите дробови. Дури и кај пациенти со висок ризик, ризикот од малигнитет кај јазли <6 mm е <1%. Ризикот од малигнитет за нодули со димензии од 6 до 20 mm се движи од 8% до 64%30. Затоа, Здружението Флајшнер препорачува гранична граница од 6 mm за рутинско следење со КТ.29 Сепак, проценката на ризикот и управувањето со неопределени белодробни нодули (IPN) поголеми од 6 mm не се соодветно извршени31. Тековното управување со вродени срцеви заболувања обично се базира на будно чекање со често КТ следење.
Врз основа на валидираниот метаболом, за прв пат демонстриравме преклопување на метаболомските потписи помеѓу здрави лица и бенигни нодули <6 mm. Биолошката сличност е во согласност со претходните наоди од КТ дека ризикот од малигнитет за нодули <6 mm е низок како кај субјекти без јазли.30 Треба да се напомене дека нашите резултати, исто така, покажуваат дека бенигните нодули <6 mm и ≥6 mm имаат голема сличност во метаболомските профили, што сугерира дека функционалната дефиниција на бенигната етиологија е конзистентна без оглед на големината на нодулите. Така, современите дијагностички панели за серумски метаболити можат да обезбедат еден тест како тест за исклучување кога нодулите првично се откриваат на КТ и потенцијално да го намалат сериското следење. Во исто време, истиот панел на метаболички биомаркери ги разликуваше малигните нодули со големина ≥6 mm од бенигните нодули и обезбеди точни предвидувања за IPN со слична големина и двосмислени морфолошки карактеристики на КТ сликите. Овој класификатор на серумски метаболизам се покажа добро во предвидувањето на малигнитетот на нодулите ≥6 mm со AUC од 0,927. Земени заедно, нашите резултати укажуваат дека уникатните серумски метаболомски потписи можат специфично да ги одразуваат раните метаболички промени предизвикани од тумор и имаат потенцијална вредност како предиктори на ризик, независно од големината на нодулите.
Имено, аденокарцином на белите дробови (LUAD) и сквамозен карцином (LUSC) се главните видови на неситноклеточен карцином на белите дробови (NSCLC). Со оглед на тоа што LUSC е силно поврзан со употребата на тутун47, а LUAD е најчестата хистологија на инцидентни белодробни нодули откриени на КТ скрининг48, нашиот модел на класификација беше специјално изграден за примероци од аденокарцином во стадиум I. Ванг и колегите, исто така, се фокусираа на LUAD и идентификуваа девет липидни потписи користејќи липидомика за да разликуваат рак на белите дробови во рана фаза од здрави лица17. Го тестиравме тековниот модел на класификација на 16 случаи на LUSC во стадиум I и 74 бенигни нодули и забележавме ниска точност на предвидување на LUSC (AUC 0,776), што сугерира дека LUAD и LUSC може да имаат свои метаболомски потписи. Всушност, е покажано дека LUAD и LUSC се разликуваат по етиологија, биолошко потекло и генетски аберации49. Затоа, други видови на хистологија треба да бидат вклучени во моделите за обука за откривање на рак на белите дробови базирано на популацијата во програмите за скрининг.
Тука, ги идентификувавме шесте најчесто изменети патишта кај аденокарцином на белите дробови во споредба со здрави контроли и бенигни нодули. Ксантинот и хипоксантинот се вообичаени метаболити на метаболичкиот пат на пуринот. Во согласност со нашите резултати, меѓупроизводите поврзани со метаболизмот на пуринот беа значително зголемени во серумот или ткивата на пациенти со аденокарцином на белите дробови во споредба со здрави контроли или пациенти во преинвазивна фаза15,50. Зголемените нивоа на серумски ксантин и хипоксантин може да го одразуваат анаболизмот потребен за брзо размножување на клетките на ракот. Дисрегулацијата на метаболизмот на гликозата е добро позната карактеристика на метаболизмот на ракот51. Овде, забележавме значително зголемување на пируват и лактат во групата LA во споредба со групата HC и BN, што е во согласност со претходните извештаи за абнормалности на гликолитичките патишта во профилите на серумските метаболоми кај пациенти со неситноклеточен карцином на белите дробови (NSCLC) и здрави контроли. Резултатите се конзистентни52,53.
Важно е да се забележи инверзна корелација помеѓу метаболизмот на пируват и триптофан во серумот на белодробни аденокарциноми. Нивоата на серумски триптофан беа намалени во групата LA во споредба со групата HC или BN. Интересно е што претходна студија од голем обем со употреба на проспективна кохорта откри дека ниските нивоа на циркулирачки триптофан се поврзани со зголемен ризик од рак на белите дробови 54. Триптофанот е есенцијална аминокиселина што ја добиваме целосно од храната. Заклучуваме дека намалувањето на серумскиот триптофан кај белодробниот аденокарцином може да одразува брзо намалување на овој метаболит. Добро е познато дека крајниот производ на катаболизмот на триптофанот преку кинуренинскиот пат е извор на de novo синтеза на NAD+. Бидејќи NAD+ се произведува првенствено преку спасувачкиот пат, важноста на NAD+ во метаболизмот на триптофанот во здравјето и болестите останува да се утврди46. Нашата анализа на базата на податоци TCGA покажа дека експресијата на транспортерот на растворени материи на триптофан 7A5 (SLC7A5) е значително зголемена кај аденокарцином на белите дробови во споредба со нормалните контроли и е позитивно корелирана со експресијата на гликолитичкиот ензим GAPDH. Претходните студии главно се фокусираа на улогата на катаболизмот на триптофанот во сузбивањето на антитуморскиот имунолошки одговор40,41,42. Овде покажуваме дека инхибицијата на апсорпцијата на триптофан со намалување на SLC7A5 во клетките на ракот на белите дробови резултира со последователно намалување на клеточните нивоа на NAD и истовремено слабеење на гликолитичката активност. Накратко, нашата студија обезбедува биолошка основа за промени во серумскиот метаболизам поврзани со малигна трансформација на аденокарцином на белите дробови.
EGFR мутациите се најчестите предизвикувачки мутации кај пациенти со NSCLC. Во нашата студија, откривме дека пациентите со EGFR мутација (n = 41) имале целокупни метаболомски профили слични на пациентите со EGFR од див тип (n = 31), иако откривме намалени серумски нивоа кај некои пациенти со EGFR мутанти кај пациенти со ацилкарнитин. Утврдената функција на ацилкарнитините е да транспортираат ацилни групи од цитоплазмата во митохондријалната матрица, што доведува до оксидација на масни киселини за производство на енергија 55. Во согласност со нашите наоди, неодамнешна студија, исто така, идентификуваше слични профили на метаболоми помеѓу EGFR мутантите и EGFR туморите од див тип со анализа на глобалниот метаболом на 102 примероци од ткиво на аденокарцином на белите дробови 50. Интересно е што содржината на ацилкарнитин беше пронајдена и во групата со EGFR мутанти. Затоа, дали промените во нивоата на ацилкарнитин ги одразуваат метаболните промени предизвикани од EGFR и основните молекуларни патишта може да заслужуваат понатамошно проучување.
Како заклучок, нашата студија воспоставува серумски метаболички класификатор за диференцијална дијагноза на пулмонални нодули и предлага работен тек што може да ја оптимизира проценката на ризикот и да го олесни клиничкото управување врз основа на скрининг со КТ скенирање.
Оваа студија беше одобрена од Етичкиот комитет на Универзитетската болница за рак „Сун Јат-сен“, Првата поврзана болница на Универзитетот „Сун Јат-сен“ и Етичкиот комитет на Универзитетската болница за рак „Џенгжу“. Во групите за откривање и внатрешна валидација, 174 серуми од здрави лица и 244 серуми од бенигни нодули беа собрани од лица кои се подложуваат на годишни медицински прегледи во Одделот за контрола и превенција на рак, Центарот за рак на Универзитетот „Сун Јат-сен“ и 166 бенигни нодули од серум. Аденокарциноми на белите дробови во стадиум I беа собрани од Центарот за рак на Универзитетот „Сун Јат-сен“. Во кохортата за надворешна валидација, имаше 48 случаи на бенигни нодули, 39 случаи на аденокарцином на белите дробови во стадиум I од Првата поврзана болница на Универзитетот „Сун Јат-сен“ и 24 случаи на аденокарцином на белите дробови во стадиум I од Болницата за рак во Џенгжу. Центарот за рак на Универзитетот „Сун Јат-сен“, исто така, собра 16 случаи на сквамозен клеточен рак на белите дробови во стадиум I за да се тестира дијагностичката способност на воспоставениот метаболички класификатор (карактеристиките на пациентите се прикажани во Дополнителната табела 5). Примероците од кохортата за откривање и кохортата за внатрешна валидација беа собрани помеѓу јануари 2018 и мај 2020 година. Примероците за кохортата за надворешна валидација беа собрани помеѓу август 2021 и октомври 2022 година. За да се минимизираат родовите предрасуди, на секоја кохорта им беа доделени приближно еднаков број на машки и женски случаи. Тим за откривање и Тим за внатрешна ревизија. Полот на учесникот беше утврден врз основа на самопријавување. Информирана согласност беше добиена од сите учесници и не беше обезбедена никаква компензација. Испитаниците со бенигни нодули беа оние со стабилен резултат на КТ скенирање на 2 до 5 години во времето на анализата, освен 1 случај од примерокот за надворешна валидација, кој беше собран пред операцијата и дијагностициран со хистопатологија. Со исклучок на хроничен бронхитис. Случаите на аденокарцином на белите дробови беа собрани пред ресекција на белите дробови и потврдени со патолошка дијагноза. Примероците од крв на гладно беа собрани во епрувети за сепарација на серум без никакви антикоагуланси. Примероците од крв беа згрутчени 1 час на собна температура, а потоа центрифугирани на 2851 × g 10 минути на 4°C за да се собере серумскиот супернатант. Серумските аликвоти беа замрзнати на -80°C до екстракција на метаболитите. Одделот за превенција на рак и медицински преглед при Центарот за рак на Универзитетот Сун Јат-сен собра збир на серум од 100 здрави донори, вклучувајќи еднаков број мажи и жени на возраст од 40 до 55 години. Еднакви количини од секој примерок од донор беа измешани, добиениот збир беше аликвотиран и складиран на -80°C. Смесата од серум беше користена како референтен материјал за контрола на квалитетот и стандардизација на податоците.
Референтниот серум и тест примероците беа одмрзнати, а метаболитите беа екстрахирани со користење на комбиниран метод на екстракција (MTBE/метанол/вода) 56. Накратко, 50 μl серум беше измешан со 225 μl ледено ладен метанол и 750 μl ледено ладен метил терт-бутил етер (MTBE). Промешајте ја смесата и инкубирајте на мраз 1 час. Потоа примероците беа измешани и измешани во вртежен момент со 188 μl вода со MS степен што содржи внатрешни стандарди (13C-лактат, 13C3-пируват, 13C-метионин и 13C6-изолеуцин, купени од Cambridge Isotope Laboratories). Смесата потоа беше центрифугирана на 15.000 × g 10 минути на 4 °C, а долната фаза беше префрлена во две епрувети (по 125 μL секоја) за LC-MS анализа во позитивен и негативен режим. Конечно, примерокот беше испарен до сувост во брз вакуумски концентратор.
Сувите метаболити беа реконституирани во 120 μl 80% ацетонитрил, вртеа 5 минути и центрифугирани на 15.000 × g 10 минути на 4°C. Супернатантните материи беа префрлени во ампери од килибарно стакло со микроинсерти за метаболомички студии. Нецелна метаболомична анализа на платформа за ултра-перформансна течна хроматографија-масена спектрометрија со висока резолуција (UPLC-HRMS). Метаболитите беа одвоени со користење на систем Dionex Ultimate 3000 UPLC и колона ACQUITY BEH амида (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). Во режим на позитивни јони, мобилните фази беа 95% (A) и 50% ацетонитрил (B), секоја содржеше 10 mmol/L амониум ацетат и 0,1% мравја киселина. Во негативен режим, мобилните фази А и Б содржеа 95% и 50% ацетонитрил, соодветно, обете фази содржеа 10 mmol/L амониум ацетат, pH = 9. Градиентната програма беше следнава: 0–0,5 мин, 2% Б; 0,5–12 мин, 2–50% Б; 12–14 мин, 50–98% Б; 14–16 мин, 98% Б; 16–16,1 мин, 98–2% Б; 16,1–20 мин, 2% Б. Колоната се одржуваше на 40°C, а примерокот на 10°C во автосемплерот. Брзината на проток беше 0,3 ml/мин, волуменот на инјектирање беше 3 μl. Масен спектрометар Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) со извор на јонизација со електроспреј (ESI) работеше во режим на целосно скенирање и поврзан со режимот на следење ddMS2 за да се соберат големи количини на податоци. MS параметрите беа поставени на следниов начин: напон на прскање +3,8 kV/- 3,2 kV, капиларна температура 320°C, заштитен гас 40 arb, помошен гас 10 arb, температура на грејачот на сондата 350°C, опсег на скенирање 70–1050 m/h, резолуција 70 000. Податоците се добиени со користење на Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
За да се процени квалитетот на податоците, беа генерирани збирни примероци за контрола на квалитет (QC) со отстранување на аликвоти од 10 μL од супернатантот од секој примерок. Шест инјекции на примероци за контрола на квалитет беа анализирани на почетокот на аналитичката секвенца за да се процени стабилноста на UPLC-MS системот. Потоа, периодично се внесуваат примероци за контрола на квалитет во серијата. Сите 11 серии на серумски примероци во оваа студија беа анализирани со LC-MS. Аликвоти од мешавина од серумски збир од 100 здрави донори беа користени како референтен материјал во соодветните серии за да се следи процесот на екстракција и да се прилагодат ефектите од серија до серија. Нецелна метаболомичка анализа на кохортата за откривање, кохортата за внатрешна валидација и кохортата за надворешна валидација беше извршена во Центарот за метаболомика на Универзитетот Сун Јат-сен. Надворешната лабораторија на Центарот за анализа и тестирање на Универзитетот за технологија Гуангдонг, исто така, анализираше 40 примероци од надворешната кохорта за да ги тестира перформансите на моделот на класификатор.
По екстракцијата и реконституцијата, апсолутната квантификација на серумските метаболити беше измерена со употреба на ултра-високо-перформансна течна хроматографија-тандем масена спектрометрија (Agilent 6495 троен квадрупол) со извор на електроспреј јонизација (ESI) во режим на повеќекратно следење на реакциите (MRM). За одвојување на метаболитите беше користена ACQUITY BEH амид колона (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). Мобилната фаза се состоеше од 90% (A) и 5% ацетонитрил (B) со 10 mmol/L амониум ацетат и 0,1% раствор на амонијак. Градиентната програма беше следнава: 0–1,5 мин, 0% B; 1,5–6,5 мин, 0–15% B; 6,5–8 мин, 15% B; 8–8,5 мин, 15%–0% B; 8,5–11,5 мин, 0% B. Колоната беше одржувана на 40 °C, а примерокот на 10 °C во автосемплерот. Брзината на проток беше 0,3 mL/min, а волуменот на инјектирање беше 1 μL. MS параметрите беа поставени на следниов начин: капиларен напон ±3,5 kV, притисок на небулизаторот 35 psi, проток на гас во обвивката 12 L/min, температура на гас во обвивката 350°C, температура на гасот за сушење 250°C и проток на гас во сушење 14 l/min. MRM конверзиите на триптофан, пируват, лактат, хипоксантин и ксантин беа 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 и 151,0–107,9 соодветно. Податоците беа собрани со користење на Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). За серумските примероци, триптофанот, пируватот, лактатот, хипоксантинот и ксантинот беа квантифицирани со помош на калибрациски криви на стандардни раствори од смеса. За клеточните примероци, содржината на триптофан беше нормализирана во однос на внатрешниот стандард и масата на клеточните протеини.
Екстракцијата на пиковите (m/z и време на задржување (RT)) беше извршена со користење на Compound Discovery 3.1 и TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). За да се елиминираат потенцијалните разлики помеѓу сериите, секој карактеристичен пик на тест примерокот беше поделен со карактеристичниот пик на референтниот материјал од истата серија за да се добие релативната застапеност. Релативните стандардни отстапувања на внатрешните стандарди пред и по стандардизацијата се прикажани во Дополнителната табела 6. Разликите помеѓу двете групи беа карактеризирани со стапка на лажно откривање (FDR <0,05, Wilcoxon означен ранг тест) и промена на превиткувањето (>1,2 или <0,83). Суровите MS податоци за екстрахираните карактеристики и референтните серумски корегирани MS податоци се прикажани во Дополнителните податоци 1 и Дополнителните податоци 2, соодветно. Анотацијата на пиковите беше извршена врз основа на четири дефинирани нивоа на идентификација, вклучувајќи идентификувани метаболити, претпоставени анотирани соединенија, претпоставени карактеризирани класи на соединенија и непознати соединенија 22. Врз основа на пребарувања во базата на податоци во Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), биолошките соединенија со MS/MS совпаѓачки валидирани стандарди или анотации за точно совпаѓање во mzCloud (резултат > 85) или Chemspider беа конечно избрани како интермедијари помеѓу диференцијалниот метаболом. Анотациите на врвовите за секоја карактеристика се вклучени во Дополнителните податоци 3. MetaboAnalyst 5.0 беше користен за униваријантна анализа на изобилството на метаболити со нормализиран збир. MetaboAnalyst 5.0, исто така, ја оцени анализата за збогатување на KEGG патеката врз основа на значително различни метаболити. Анализата на главните компоненти (PCA) и делумната дискриминантна анализа на најмали квадрати (PLS-DA) беа анализирани со користење на софтверскиот пакет ropls (v.1.26.4) со нормализација на стекот и автоматско скалирање. Оптималниот модел на биомаркер на метаболити за предвидување на малигнитет на нодулите беше генериран со користење на бинарна логистичка регресија со најмало апсолутно намалување и оператор за селекција (LASSO, R пакет v.4.1-3). Перформансите на дискриминантниот модел во множествата за детекција и валидација беа карактеризирани со проценка на AUC врз основа на ROC анализа според пакетот pROC (v.1.18.0.). Оптималната граница на веројатност беше добиена врз основа на максималниот Јуденов индекс на моделот (сензитивност + специфичност – 1). Примероците со вредности помали или поголеми од прагот ќе бидат предвидени како бенигни нодули и белодробен аденокарцином, соодветно.
Клетките A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) беа одгледувани во F-12K медиум што содржи 10% FBS. Секвенците на кратка РНК во облик на шнола (shRNA) насочени кон SLC7A5 и нецелна контрола (NC) беа вметнати во лентивиралниот вектор pLKO.1-puro. Антисенс секвенците на shSLC7A5 се следниве: Sh1 (5′-GGAGAAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Антителата кон SLC7A5 (#5347) и тубулин (#2148) беа купени од Cell Signaling Technology. Антителата кон SLC7A5 и тубулин беа користени во разредување од 1:1000 за анализа на Western blot.
Гликолитичкиот стрес тест Seahorse XF ги мери нивоата на екстрацелуларна ацидификација (ECAR). Во анализата, гликоза, олигомицин А и 2-DG беа администрирани последователно за да се тестира клеточниот гликолитички капацитет мерен со ECAR.
A549 клетки трансфектирани со нецелна контрола (NC) и shSLC7A5 (Sh1, Sh2) беа положени преку ноќ во садови со дијаметар од 10 cm. Метаболитите на клетките беа екстрахирани со 1 ml ледено ладен 80% воден метанол. Клетките во растворот од метанол беа стругани, собрани во нова епрувета и центрифугирани на 15.000 × g 15 минути на 4°C. Соберете 800 µl супернатант и исушете ги со помош на брз вакуумски концентратор. Исушените пелети од метаболити потоа беа анализирани за нивоа на триптофан со помош на LC-MS/MS како што е опишано погоре. Клеточните нивоа на NAD(H) во A549 клетките (NC и shSLC7A5) беа мерени со помош на квантитативен NAD+/NADH колориметриски комплет (#K337, BioVision) според упатствата на производителот. Нивоата на протеини беа мерени за секој примерок за да се нормализира количината на метаболити.
Не беа користени статистички методи за прелиминарно одредување на големината на примерокот. Претходните метаболомички студии насочени кон откривање на биомаркери15,18 се сметаа за репер за одредување на големината, и во споредба со овие извештаи, нашиот примерок беше соодветен. Ниеден примерок не беше исклучен од студиската кохорта. Серумските примероци беа случајно доделени на група за откривање (306 случаи, 74,6%) и група за внатрешна валидација (104 случаи, 25,4%) за нецелни метаболомички студии. Исто така, случајно избравме 70 случаи од секоја група од множеството откритија за целни метаболомички студии. Истражувачите беа слепи за распределба на групи за време на собирањето и анализата на податоци од LC-MS. Статистичките анализи на метаболомичките податоци и клеточните експерименти се опишани во соодветните делови Резултати, Легенди на слики и Методи. Квантификацијата на клеточниот триптофан, NADT и гликолитичката активност беше извршена три пати независно со идентични резултати.
За повеќе информации во врска со дизајнот на студијата, видете го апстрактот на извештајот за природно портфолио поврзан со оваа статија.
Суровите MS податоци за извлечените карактеристики и нормализираните MS податоци од референтниот серум се прикажани во Дополнителните податоци 1 и Дополнителните податоци 2, соодветно. Анотациите на врвовите за диференцијалните карактеристики се прикажани во Дополнителните податоци 3. Збирот податоци LUAD TCGA може да се преземе од https://portal.gdc.cancer.gov/. Влезните податоци за цртање на графиконот се дадени во изворните податоци. Изворните податоци се дадени за овој напис.
Национална студиска група за скрининг на белите дробови, итн. Намалување на смртноста од рак на белите дробови со компјутеризирана томографија со ниска доза. Северна Англија. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Крамер, БС, Берг, КД, Аберле, ДР и Профет, ПЦ Скрининг за рак на белите дробови со употреба на спирален КТ со ниска доза: резултати од Националната студија за скрининг на белите дробови (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
Де Конинг, ХЈ, и др. Намалување на смртноста од рак на белите дробови со волуметриски КТ скрининг во рандомизирано испитување. Северна Англија. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Време на објавување: 18 септември 2023 година