Диференцијалната дијагноза на пулмоналните јазли идентификувани со компјутерска томографија (КТ) останува предизвик во клиничката пракса.Овде, го карактеризираме глобалниот метаболом на 480 серумски примероци, вклучувајќи здрави контроли, бенигни белодробни нодули и аденокарцином на белите дробови во стадиум I.Аденокарциномите покажуваат уникатни метаболомски профили, додека бенигните јазли и здравите индивидуи имаат висока сличност во метаболичките профили.Во групата за откривање (n = 306), беше идентификуван сет од 27 метаболити за да се направи разлика помеѓу бенигни и малигни јазли.AUC на дискриминантниот модел во групите за внатрешна валидација (n = 104) и надворешна валидација (n = 111) беше 0,915 и 0,945, соодветно.Анализата на патеката откри зголемени гликолитички метаболити поврзани со намален триптофан во серумот на аденокарцином на белите дробови во споредба со бенигните јазли и здравите контроли, и сугерираше дека навлегувањето на триптофан промовира гликолиза во клетките на ракот на белите дробови.Нашата студија ја нагласува вредноста на биомаркерите на серумскиот метаболит во проценката на ризикот од белодробни нодули откриени со КТ.
Раната дијагноза е од клучно значење за подобрување на стапката на преживување кај пациентите со рак.Резултатите од американското национално испитување за скрининг на рак на белите дробови (NLST) и Европската студија NELSON покажаа дека скринингот со компјутеризирана томографија (LDCT) со ниски дози може значително да ја намали смртноста од рак на белите дробови кај високоризичните групи1,2,3.Од широката употреба на LDCT за скрининг на рак на белите дробови, инциденцата на случајни радиографски наоди на асимптоматски белодробни јазли продолжи да се зголемува 4 .Белодробните нодули се дефинирани како фокални непроѕирности до 3 cm во дијаметар 5 .Се соочуваме со потешкотии во проценката на веројатноста за малигнитет и справувањето со големиот број пулмонални јазли откриени случајно на LDCT.Ограничувањата на КТ може да доведат до чести последователни прегледи и лажно-позитивни резултати, што доведува до непотребна интервенција и претерана терапија6.Затоа, постои потреба да се развијат сигурни и корисни биомаркери за правилно да се идентификува ракот на белите дробови во раните фази и да се диференцираат повеќето бенигни јазли при првично откривање 7 .
Сеопфатната молекуларна анализа на крвта (серум, плазма, мононуклеарни клетки на периферната крв), вклучително и геномика, протеомика или метилација на ДНК8,9,10, доведе до зголемен интерес за откривање на дијагностички биомаркери за рак на белите дробови.Во меѓувреме, пристапите на метаболомика ги мерат клеточните крајни производи кои се под влијание на ендогени и егзогени дејства и затоа се применуваат за да се предвиди почетокот и исходот на болеста.Течна хроматографија-тандем масена спектрометрија (LC-MS) е широко користен метод за метаболомични студии поради неговата висока чувствителност и големиот динамички опсег, кој може да покрие метаболити со различни физичко-хемиски својства11,12,13.Иако глобалната метаболичка анализа на плазмата/серумот е користена за да се идентификуваат биомаркерите поврзани со дијагнозата на рак на белите дробови14,15,16,17 и ефикасноста на третманот,18 класификатори на серумски метаболити за да се направи разлика помеѓу бенигните и малигните белодробни јазли останува да бидат многу проучувани.- масовно истражување.
Аденокарцином и сквамозен карцином се двата главни подтипа на неситноклеточен карцином на белите дробови (NSCLC).Различни КТ скрининг тестови покажуваат дека аденокарцином е најчестиот хистолошки тип на рак на белите дробови1,19,20,21.Во оваа студија, користевме течна хроматографија со ултра-перформансна масена спектрометрија со висока резолуција (UPLC-HRMS) за да извршиме метаболомична анализа на вкупно 695 серумски примероци, вклучувајќи здрави контроли, бенигни белодробни нодули и ≤3 cm откриени со КТ.Скрининг за аденокарцином на белите дробови во стадиум I.Идентификувавме панел на серумски метаболити кои го разликуваат аденокарцином на белите дробови од бенигни нодули и здрави контроли.Анализата за збогатување на патеката откри дека абнормалниот метаболизам на триптофан и гликоза се вообичаени промени кај аденокарцином на белите дробови во споредба со бенигните јазли и здравите контроли.Конечно, воспоставивме и потврдивме серумски метаболички класификатор со висока специфичност и чувствителност за да се направи разлика помеѓу малигните и бенигните пулмонални јазли откриени со LDCT, што може да помогне во раната диференцијална дијагноза и проценка на ризикот.
Во тековната студија, примероци од серум според полот и возраста беа ретроспективно собрани од 174 здрави контроли, 292 пациенти со бенигни пулмонални јазли и 229 пациенти со аденокарцином на белите дробови во стадиум I.Демографските карактеристики на 695 субјекти се прикажани во дополнителна табела 1.
Како што е прикажано на Слика 1а, вкупно 480 серумски примероци, вклучувајќи 174 здрава контрола (HC), 170 бенигни нодули (BN) и 136 примероци од стадиум I на белодробниот аденокарцином (LA), беа собрани во Универзитетскиот центар за рак на Sun Yat-sen.Кохорта за откривање за нетаргетирано метаболомско профилирање со употреба на течна хроматографија со ултра перформанси-масена спектрометрија со висока резолуција (UPLC-HRMS).Како што е прикажано на дополнителната слика 1, диференцијалните метаболити помеѓу LA и HC, LA и BN беа идентификувани за да се воспостави модел на класификација и дополнително да се истражи анализата на диференцијалната патека.104 примероци собрани од Центарот за рак на Универзитетот Сун Јат-сен и 111 примероци собрани од две други болници беа подложени на внатрешна и надворешна валидација, соодветно.
Студиска популација во групата на откритија која беше подложена на глобална серумска метаболомична анализа користејќи ултра-перформансна течна хроматографија-масена спектрометрија со висока резолуција (UPLC-HRMS).б. (Лос Анџелес, n = 136).+ESI, позитивен режим на јонизација со електропрскање, -ESI, негативен режим на јонизација со електропрскање.c–e Метаболитите со значително различно изобилство во две дадени групи (двоопашест тест за рангирање со знакот на Wilcoxon, прилагодена вредност на стапката на лажно откривање p, FDR <0,05) се прикажани со црвено (промена на пати > 1,2) и сино (промена на пати < 0,83) .) прикажано на графиката на вулканот.ѓ Хиерархиска топлинска карта за групирање покажува значајни разлики во бројот на означени метаболити помеѓу LA и BN.Изворните податоци се обезбедуваат во форма на датотеки со изворни податоци.
Вкупниот серумски метаболом од 174 HC, 170 BN и 136 LA во групата за откривање беше анализиран со помош на UPLC-HRMS анализа.Прво покажуваме дека примероците за контрола на квалитетот (QC) цврсто се групираат во центарот на моделот за анализа на главна компонента (PCA) без надзор, што ја потврдува стабилноста на перформансите на тековната студија (Дополнителна слика 2).
Како што е прикажано во анализата за делумна дискриминација на најмали квадрати (PLS-DA) на Слика 1 б, откривме дека има јасни разлики помеѓу LA и BN, LA и HC во позитивни (+ESI) и негативни (-ESI) режими на јонизација со електропрскање .изолирани.Сепак, не беа пронајдени значајни разлики помеѓу BN и HC во +ESI и -ESI услови.
Најдовме 382 диференцијални карактеристики помеѓу LA и HC, 231 диференцијални карактеристики помеѓу LA и BN и 95 диференцијални карактеристики помеѓу BN и HC (Вилкоксон потпишан тест за ранг, FDR <0,05 и повеќекратна промена >1,2 или <0,83) (Слика .1c-e )..Врвовите беа дополнително забележани (Дополнителни податоци 3) во однос на базата на податоци (mzCloud/HMDB/Chemspider библиотека) по m/z вредност, време на задржување и пребарување на масен спектар на фрагментација (детали опишани во делот Методи) 22 .Конечно, 33 и 38 означени метаболити со значителни разлики во изобилството беа идентификувани за LA наспроти BN (Слика 1f и Дополнителна табела 2) и LA наспроти HC (Дополнителна слика 3 и Дополнителна табела 2), соодветно.Спротивно на тоа, само 3 метаболити со значителни разлики во изобилството беа идентификувани во BN и HC (Дополнителна табела 2), во согласност со преклопувањето помеѓу BN и HC во PLS-DA.Овие диференцијални метаболити покриваат широк опсег на биохемикалии (Дополнителна слика 4).Земени заедно, овие резултати покажуваат значајни промени во серумскиот метаболом што ја рефлектираат малигната трансформација на ракот на белите дробови во рана фаза во споредба со бенигните белодробни јазли или здрави субјекти.Во меѓувреме, сличноста на серумскиот метаболом на BN и HC сугерира дека бенигните пулмонални јазли може да споделуваат многу биолошки карактеристики со здрави индивидуи.Со оглед на тоа што генските мутации на рецепторот на епидермален фактор на раст (EGFR) се вообичаени кај подтипот 23 на аденокарцином на белите дробови, се обидовме да го одредиме влијанието на двигателските мутации врз серумскиот метаболом.Потоа го анализиравме целокупниот метаболомски профил на 72 случаи со статус на EGFR во групата на белодробен аденокарцином.Интересно, најдовме споредливи профили помеѓу пациенти со EGFR мутант (n = 41) и EGFR пациенти од див тип (n = 31) во PCA анализата (Дополнителна слика 5а).Сепак, идентификувавме 7 метаболити чиешто изобилство беше значително променето кај пациенти со мутација на EGFR во споредба со пациентите со EGFR од див тип (t тест, p <0,05 и пати промена > 1,2 или < 0,83) (Дополнителна слика 5б).Поголемиот дел од овие метаболити (5 од 7) се ацилкарнитини, кои играат важна улога во патиштата на оксидација на масни киселини.
Како што е илустрирано во работниот тек прикажан на Слика 2 а, биомаркерите за класификација на јазлите се добиени со користење на најмалку апсолутни оператори за собирање и селекција врз основа на 33 диференцијални метаболити идентификувани во LA (n = 136) и BN (n = 170).Најдобра комбинација на променливи (LASSO) – бинарен логистички регресивен модел.Беше искористена десеткратна вкрстена валидација за тестирање на веродостојноста на моделот.Изборот на променливата и регулацијата на параметрите се приспособуваат со казна за максимизирање на веројатноста со параметар λ24.Глобалната метаболомична анализа дополнително беше извршена независно во групите за внатрешна валидација (n = 104) и надворешна валидација (n = 111) за да се тестираат перформансите на класификацијата на дискриминантниот модел.Како резултат на тоа, 27 метаболити во комплетот за откривање беа идентификувани како најдобар модел за дискриминација со најголема средна вредност на AUC (сл. 2б), меѓу кои 9 имаа зголемена активност и 18 намалена активност во LA во споредба со BN (сл. 2в).
Работен тек за изградба на класификатор на пулмонални јазли, вклучително и избирање на најдобриот панел на серумски метаболити во комплетот за откривање со користење на модел на бинарна логистичка регресија преку десеткратна вкрстена валидација и проценка на предвидливите перформанси во сетови за внатрешна и надворешна валидација.б статистика за вкрстена валидација на моделот за регресија на LASSO за избор на метаболички биомаркери.Броевите дадени погоре го претставуваат просечниот број на биомаркери избрани на дадена λ.Црвената линија со точки ја претставува просечната вредност на AUC на соодветната ламбда.Сивите ленти за грешки ги претставуваат минималните и максималните вредности на AUC.Испрекината линија го означува најдобриот модел со 27 избрани биомаркери.AUC, површина под кривата на оперативните карактеристики на приемникот (ROC).c Преклопете ги промените на 27 избрани метаболити во групата LA во споредба со групата BN во групата за откривање.Црвена колона – активирање.Сината колона е пад.d–f Криви на оперативни карактеристики на приемникот (ROC) кои ја покажуваат моќта на моделот за дискриминација заснован на 27 комбинации на метаболити во комплетите за откривање, внатрешна и надворешна валидација.Изворните податоци се обезбедуваат во форма на датотеки со изворни податоци.
Беше создаден модел на предвидување врз основа на пондерираните коефициенти на регресија на овие 27 метаболити (Дополнителна табела 3).Анализата на ROC врз основа на овие 27 метаболити даде површина под вредноста на кривата (AUC) од 0,933, чувствителноста на групата за откривање беше 0,868, а специфичноста беше 0,859 (сл. 2г).Во меѓувреме, меѓу 38 означени диференцијални метаболити помеѓу LA и HC, сет од 16 метаболити постигнаа AUC од 0,902 со чувствителност од 0,801 и специфичност од 0,856 во разликувањето на LA од HC (Дополнителна слика 6а-в).Исто така, беа споредувани вредностите на AUC врз основа на различни прагови на промена на пати за диференцијални метаболити.Откривме дека моделот на класификација се покажа најдобро во дискриминацијата помеѓу LA и BN (HC) кога нивото на промена на преклопот беше поставено на 1,2 наспроти 1,5 или 2,0 (Дополнителна слика 7а,б).Моделот на класификација, базиран на 27 метаболитни групи, дополнително беше потврден во внатрешни и надворешни групи.AUC беше 0,915 (чувствителност 0,867, специфичност 0,811) за внатрешна валидација и 0,945 (чувствителност 0,810, специфичност 0,979) за надворешна валидација (сл. 2e, f).За да се процени меѓулабораториската ефикасност, 40 примероци од надворешната група беа анализирани во надворешна лабораторија како што е опишано во делот Методи.Прецизноста на класификацијата постигна AUC од 0,925 (Дополнителна слика 8).Бидејќи белодробниот сквамозен карцином (LUSC) е вториот најчест подтип на неситноклеточен карцином на белите дробови (NSCLC) по белодробниот аденокарцином (LUAD), ние исто така ја тестиравме потврдената потенцијална корист на метаболичките профили.БН и 16 случаи на LUSC.AUC на дискриминација помеѓу LUSC и BN беше 0,776 (Дополнителна слика 9), што укажува на послаба способност во споредба со дискриминацијата помеѓу LUAD и BN.
Студиите покажаа дека големината на јазлите на КТ сликите е во позитивна корелација со веројатноста за малигнитет и останува главна детерминанта за третман на јазли25,26,27.Анализата на податоците од големата група на скрининг студијата NELSON покажа дека ризикот од малигнитет кај субјектите со јазли <5 mm е дури сличен на оној кај субјектите без јазли 28 .Затоа, минималната големина за која е потребен редовен КТ мониторинг е 5 mm, како што е препорачано од Британското торакално друштво (BTS), и 6 mm, како што е препорачано од здружението Fleischner 29 .Сепак, нодулите поголеми од 6 mm и без очигледни бенигни карактеристики, наречени неодредени белодробни нодули (IPN), остануваат главен предизвик во евалуацијата и управувањето во клиничката пракса30,31.Следно испитавме дали големината на јазолот влијаеше на метаболичките потписи користејќи здружени примероци од групите за откривање и внатрешна валидација.Фокусирајќи се на 27 потврдени биомаркери, прво ги споредивме PCA профилите на метаболомите на HC и BN под-6 mm.Откривме дека повеќето од точките на податоци за HC и BN се преклопуваат, што покажува дека нивоата на серумските метаболити се слични во двете групи (сл. 3а).Картите на карактеристиките низ различни опсези на големини останаа зачувани во BN и LA (сл. 3б, в), додека беше забележано одвојување помеѓу малигните и бенигните јазли во опсегот од 6-20 mm (сл. 3d).Оваа група имаше AUC од 0,927, специфичност од 0,868 и чувствителност од 0,820 за предвидување на малигнитет на нодули со димензии од 6 до 20 mm (сл. 3e, f).Нашите резултати покажуваат дека класификаторот може да ги долови метаболните промени предизвикани од раната малигна трансформација, без оглед на големината на јазолот.
ad Споредба на PCA профили помеѓу одредени групи врз основа на метаболички класификатор од 27 метаболити.CC и BN < 6 mm.b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm.во LA 6-20 mm наспроти LA 20-30 mm.g BN 6–20 mm и LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Крива на оперативна карактеристика (ROC) на ресиверот што ги покажува перформансите на дискриминантниот модел за нодули 6–20 mm.ѓ Вредностите на веројатноста се пресметани врз основа на моделот на логистичка регресија за нодули со големина од 6-20 mm.Сивата линија со точки ја претставува оптималната вредност на исклучување (0,455).Броевите погоре го претставуваат процентот на случаи предвидени за Лос Анџелес.Користете студентски т тест со две опашки.PCA, анализа на главна компонента.AUC област под кривата.Изворните податоци се обезбедуваат во форма на датотеки со изворни податоци.
Четири примероци (на возраст од 44-61 година) со слични големини на пулмонални јазли (7-9 mm) беа дополнително избрани за да се илустрираат перформансите на предложениот модел за предвидување малигнитет (сл. 4а, б).На првичниот скрининг, Случај 1 се претстави како солиден јазол со калцификација, карактеристика поврзана со бенигнитет, додека случајот 2 претставен како неопределен делумно цврст јазол без очигледни бенигни карактеристики.Три круга на последователни КТ скенови покажаа дека овие случаи останаа стабилни во период од 4 години и затоа се сметаа за бенигни јазли (сл. 4а).Во споредба со клиничката евалуација на сериските КТ скенови, анализата на серумскиот метаболит со еднократно снимање со тековниот модел на класификатор брзо и правилно ги идентификуваше овие бенигни јазли врз основа на веројатни ограничувања (Табела 1).Слика 4б во случајот 3 покажува јазол со знаци на плеврална ретракција, што најчесто се поврзува со малигнитет32.Случај 4 претставен како неодреден делумно цврст јазол без докази за бенигна причина.Сите овие случаи беа предвидени како малигни според моделот на класификатор (Табела 1).Проценката на белодробниот аденокарцином беше докажана со хистопатолошки преглед по операцијата за ресекција на белите дробови (сл. 4б).За сетот за надворешна валидација, метаболичкиот класификатор точно предвидел два случаи на неопределени белодробни нодули поголеми од 6 mm (Дополнителна слика 10).
КТ слики на аксијалниот прозорец на белите дробови на два случаи на бенигни јазли.Во случајот 1, КТ скен по 4 години покажа стабилен цврст јазол со димензии 7 mm со калцификација во десниот долен лобус.Во случајот 2, КТ скенирањето по 5 години откри стабилен, делумно цврст јазол со дијаметар од 7 mm во десниот горен лобус.б КТ снимки од аксијален прозорец на белите дробови и соодветните патолошки студии на два случаи на аденокарцином во стадиум I пред ресекција на белите дробови.Случај 3 откри јазол со дијаметар од 8 mm во десниот горен лобус со плеврална ретракција.Случајот 4 откри делумно цврст јазол од мелено стакло со димензии 9 mm во левиот горен лобус.Боење со хематоксилин и еозин (H&E) на ресецираното белодробно ткиво (бар на скала = 50 μm) што го демонстрира моделот на ацинарен раст на белодробниот аденокарцином.Стрелките укажуваат на нодули откриени на КТ сликите.Сликите на H&E се репрезентативни слики на повеќе (>3) микроскопски полиња испитани од патологот.
Земени заедно, нашите резултати ја демонстрираат потенцијалната вредност на биомаркерите на серумскиот метаболит во диференцијалната дијагноза на пулмоналните јазли, што може да претставува предизвици при евалуација на КТ скрининг.
Врз основа на потврдена диференцијална метаболитна табла, се обидовме да ги идентификуваме биолошките корелации на главните метаболички промени.Анализата за збогатување на патеката KEGG од MetaboAnalyst идентификуваше 6 вообичаени значително изменети патишта помеѓу двете дадени групи (LA наспроти HC и LA наспроти BN, приспособени p ≤ 0,001, ефект > 0,01).Овие промени се карактеризираат со нарушувања во метаболизмот на пируватите, метаболизмот на триптофан, метаболизмот на ниацин и никотинамид, гликолизата, циклусот TCA и метаболизмот на пурините (сл. 5а).Потоа дополнително извршивме насочена метаболомика за да ги потврдиме големите промени користејќи апсолутна квантификација.Определување на заеднички метаболити во вообичаено променетите патишта со тројна четириполна масена спектрометрија (QQQ) со користење на автентични стандарди за метаболит.Демографските карактеристики на целниот примерок од студијата за метаболомика се вклучени во дополнителната табела 4. Во согласност со нашите резултати од глобалната метаболомика, квантитативната анализа потврди дека хипоксантинот и ксантинот, пируватот и лактат се зголемени во LA во споредба со BN и HC (сл. 5б, в, стр <0,05).Сепак, не беа пронајдени значајни разлики во овие метаболити помеѓу BN и HC.
Анализа на збогатување на патот на KEGG на значително различни метаболити во групата LA во споредба со групите BN и HC.Беше користен Глобал тест со две опашки, а вредностите на p беа приспособени со методот Холм-Бонферони (прилагоден p ≤ 0,001 и големина на ефектот > 0,01).b-d Виолински снимки кои покажуваат нивоа на хипоксантин, ксантин, лактат, пируват и триптофан во серумскиот HC, BN и LA утврдени со LC-MS/MS (n = 70 по група).Белите и црните точки со точки ја означуваат средната и кварталот, соодветно.д Виолина графика која покажува нормализирана Log2TPM (транскрипти на милион) mRNA изразување на SLC7A5 и QPRT во аденокарцином на белите дробови (n = 513) во споредба со нормалното белодробно ткиво (n = 59) во базата на податоци LUAD-TCGA.Белата кутија го претставува интеркварталниот опсег, хоризонталната црна линија во центарот ја претставува медијаната, а вертикалната црна линија што се протега од полето го претставува интервалот на доверба од 95% (CI).f Pearson корелација запис на SLC7A5 и GAPDH експресија во белодробен аденокарцином (n = 513) и нормално белодробно ткиво (n = 59) во базата на податоци TCGA.Сивата област претставува 95% CI.r, Пирсон коефициент на корелација.г.Прикажана е статистичка анализа на пет биолошки независни примероци во секоја група.h Клеточните нивоа на NADt (вкупно NAD, вклучувајќи NAD+ и NADH) во ќелиите A549 (NC) и SLC7A5 соборуваат A549 клетки (Sh1, Sh2).Прикажана е статистичка анализа на три биолошки независни примероци во секоја група.i Гликолитичката активност на A549 клетките пред и по соборувањето на SLC7A5 беше измерена со стапка на екстрацелуларна закиселување (ECAR) (n = 4 биолошки независни примероци по група).2-DG,2-деокси-D-гликоза.T тестот со две опашки беше користен во (b–h).Во (g–i), лентите за грешки ја претставуваат средната вредност ± SD, секој експеримент беше изведен три пати независно и резултатите беа слични.Изворните податоци се обезбедуваат во форма на датотеки со изворни податоци.
Имајќи го предвид значајното влијание на изменетиот метаболизам на триптофан во групата LA, ги проценивме и нивоата на серумскиот триптофан во HC, BN и LA групите користејќи QQQ.Откривме дека серумскиот триптофан е намален во LA во споредба со HC или BN (p <0,001, Слика 5г), што е во согласност со претходните наоди дека нивоата на триптофан во циркулацијата се пониски кај пациенти со рак на белите дробови отколку кај здрави контроли од контролната група33,34 , 35.Друга студија користејќи PET/CT трасер 11C-метил-L-триптофан покажа дека времето на задржување на сигналот на триптофан во ткивото на ракот на белите дробови е значително зголемено во споредба со бенигните лезии или нормалното ткиво36.Претпоставуваме дека намалувањето на триптофанот во LA серумот може да го одрази активното навлегување на триптофан од клетките на ракот на белите дробови.
Исто така, познато е дека крајниот производ на кинуренинската патека на катаболизмот на триптофан е NAD+37,38, кој е важен супстрат за реакцијата на глицералдехид-3-фосфат со 1,3-бисфосфоглицерат при гликолиза39.Додека претходните студии се фокусираа на улогата на катаболизмот на триптофан во имунолошката регулација, ние се обидовме да ја разјасниме интеракцијата помеѓу дисрегулацијата на триптофан и гликолитичките патишта забележани во тековната студија.Познато е дека 7-членото семејство на транспортери на растворени материи (SLC7A5) е транспортер на триптофан43,44,45.Кинолинска киселина фосфорибосилтрансфераза (QPRT) е ензим лоциран низводно од патеката на кинуренин кој ја претвора кинолинската киселина во NAMN46.Инспекцијата на базата на податоци на LUAD TCGA откри дека и SLC7A5 и QPRT беа значително регулирани во туморското ткиво во споредба со нормалното ткиво (сл. 5д).Ова зголемување беше забележано во фазите I и II, како и во фазите III и IV на аденокарцином на белите дробови (Дополнителна слика 11), што укажува на рани нарушувања во метаболизмот на триптофан поврзани со туморигенезата.
Дополнително, базата на податоци LUAD-TCGA покажа позитивна корелација помеѓу SLC7A5 и GAPDH mRNA изразувањето во примероците на пациенти со рак (r = 0,45, p = 1,55E-26, Слика 5f).Спротивно на тоа, не беше пронајдена значајна корелација помеѓу таквите генски потписи во нормалното белодробно ткиво (r = 0,25, p = 0,06, Слика 5f).Соборувањето на SLC7A5 (Дополнителна слика 12) во клетките A549 значително ги намали нивоата на клеточниот триптофан и NAD(H) (слика 5g,h), што резултира со атенуирана гликолитичка активност како што се мери со стапката на екстрацелуларна ацидификација (ECAR) (Слика 1).5i).Така, врз основа на метаболичките промени во серумот и ин витро откривањето, претпоставуваме дека метаболизмот на триптофан може да произведе NAD + преку кинуренин патеката и да игра важна улога во промовирањето на гликолизата кај ракот на белите дробови.
Студиите покажаа дека голем број на неодредени белодробни јазли откриени со LDCT може да доведат до потреба од дополнителни тестирања како што се PET-CT, биопсија на белите дробови и претерана терапија поради лажно позитивна дијагноза на малигнитет.31 Како што е прикажано на Слика 6. нашата студија идентификуваше панел од серумски метаболити со потенцијална дијагностичка вредност што може да ја подобри стратификацијата на ризикот и последователно управување со пулмоналните јазли откриени со КТ.
Белодробните јазли се евалуираат со користење на компјутеризирана томографија (LDCT) со мала доза со карактеристики на слика што укажуваат на бенигни или малигни причини.Неизвесниот исход на јазлите може да доведе до чести последователни посети, непотребни интервенции и претерано лекување.Вклучувањето на серумските метаболички класификатори со дијагностичка вредност може да ја подобри проценката на ризикот и последователниот третман на пулмоналните јазли.ПЕТ позитронска емисиона томографија.
Податоците од американската студија NLST и европската студија NELSON сугерираат дека скринингот на високоризичните групи со компјутеризирана томографија (LDCT) со ниски дози може да ја намали смртноста од рак на белите дробови1,3.Сепак, проценката на ризикот и последователниот клинички менаџмент на голем број случајни пулмонални јазли откриени со LDCT остануваат најпредизвикувачките.Главната цел е да се оптимизира правилната класификација на постоечките протоколи базирани на LDCT со инкорпорирање на сигурни биомаркери.
Одредени молекуларни биомаркери, како што се метаболитите на крвта, се идентификувани со споредување на ракот на белите дробови со здрави контроли15,17.Во тековната студија, ние се фокусиравме на примената на серумската метаболомична анализа за да се направи разлика помеѓу бенигните и малигните пулмонални јазли случајно откриени со LDCT.Го споредивме глобалниот серумски метаболом на здравата контрола (HC), бенигните белодробни јазли (BN) и примероците на белодробниот аденокарцином (LA) од стадиум I користејќи UPLC-HRMS анализа.Откривме дека HC и BN имале слични метаболички профили, додека LA покажале значителни промени во споредба со HC и BN.Идентификувавме две групи на серумски метаболити кои го разликуваат LA од HC и BN.
Тековната шема за идентификација базирана на LDCT за бенигни и малигни јазли главно се заснова на големината, густината, морфологијата и стапката на раст на јазлите со текот на времето30.Претходните студии покажаа дека големината на јазлите е тесно поврзана со веројатноста за појава на рак на белите дробови.Дури и кај пациенти со висок ризик, ризикот од малигнитет кај јазлите <6 mm е <1%.Ризикот од малигнитет за јазли со големина од 6 до 20 mm се движи од 8% до 64%30.Затоа, Здружението Fleischner препорачува пресечен дијаметар од 6 mm за рутинско следење на КТ.29 Сепак, проценката на ризикот и управувањето со неодредени белодробни јазли (IPN) поголеми од 6 mm не се соодветно извршени 31 .Тековниот менаџмент на вродени срцеви заболувања обично се заснова на внимателно чекање со чести КТ мониторинг.
Врз основа на потврдениот метаболом, за прв пат демонстриравме преклопување на метаболичките потписи помеѓу здрави индивидуи и бенигни јазли <6 mm.Биолошката сличност е конзистентна со претходните наоди на КТ дека ризикот од малигнитет за јазли <6 mm е исто толку низок како и за испитаниците без јазли.30 Треба да се забележи дека нашите резултати исто така покажуваат дека бенигните јазли <6 mm и ≥6 mm имаат висока сличност во метаболичките профили, што сугерира дека функционалната дефиниција за бенигна етиологија е конзистентна без оглед на големината на јазлите.Така, современите дијагностички серумски метаболитни панели може да обезбедат единечна анализа како исклучен тест кога првично се детектираат нодули на КТ и потенцијално го намалуваат серискиот мониторинг.Во исто време, истиот панел на метаболички биомаркери ги разликува малигните јазли со големина ≥6 mm од бенигните нодули и обезбеди точни предвидувања за IPN со слична големина и двосмислени морфолошки карактеристики на КТ сликите.Овој класификатор на серумскиот метаболизам имаше добри резултати во предвидувањето на малигнитет на јазли ≥6 mm со AUC од 0,927.Земени заедно, нашите резултати покажуваат дека уникатните серумски метаболички потписи можат конкретно да ги рефлектираат раните метаболички промени предизвикани од тумор и да имаат потенцијална вредност како предвидувачи на ризик, независно од големината на јазлите.
Имено, белодробниот аденокарцином (LUAD) и сквамозниот карцином (LUSC) се главните типови на неситноклеточен карцином на белите дробови (NSCLC).Имајќи предвид дека LUSC е силно поврзан со употребата на тутун47 и LUAD е најчеста хистологија на случајни белодробни нодули откриени на КТ скрининг48, нашиот класификатор модел беше специјално изграден за примероци од аденокарцином во фаза I.Ванг и колегите, исто така, се фокусираа на LUAD и идентификуваа девет липидни потписи користејќи липидомика за да се разликува ракот на белите дробови во рана фаза од здрави индивидуи17.Го тестиравме тековниот модел на класификатор на 16 случаи на фаза I LUSC и 74 бенигни јазли и забележавме ниска точност на предвидување LUSC (AUC 0,776), што сугерира дека LUAD и LUSC може да имаат свои метаболички знаци.Навистина, се покажа дека LUAD и LUSC се разликуваат по етиологија, биолошко потекло и генетски аберации49.Затоа, други видови на хистологија треба да се вклучат во моделите за обука за откривање на рак на белите дробови базирано на население во програмите за скрининг.
Овде, ги идентификувавме шесте најчесто променети патишта кај белодробниот аденокарцином во споредба со здравите контроли и бенигните јазли.Ксантин и хипоксантин се вообичаени метаболити на пуринскиот метаболички пат.Во согласност со нашите резултати, посредниците поврзани со метаболизмот на пурините беа значително зголемени во серумот или ткивата на пациентите со белодробен аденокарцином во споредба со здравите контроли или пациентите во преинвазивна фаза15,50.Зголемените серумски нивоа на ксантин и хипоксантин може да го рефлектираат анаболизмот потребен од брзото размножување на клетките на ракот.Дисрегулацијата на метаболизмот на гликозата е добро позната карактеристика на метаболизмот на ракот51.Овде, забележавме значително зголемување на пируватот и лактатот во групата LA во споредба со групата HC и BN, што е во согласност со претходните извештаи за абнормалности на гликолитичкиот пат во профилите на серумскиот метаболом на пациенти со неситноклеточен карцином на белите дробови (NSCLC) и здрави контроли.резултатите се конзистентни52,53.
Поважно, забележавме инверзна корелација помеѓу метаболизмот на пируватот и триптофанот во серумот на белодробните аденокарциноми.Нивоата на серумскиот триптофан беа намалени во групата LA во споредба со групата HC или BN.Интересно е што една претходна голема студија со помош на проспективна група покажа дека ниските нивоа на циркулирачки триптофан се поврзани со зголемен ризик од рак на белите дробови 54 .Триптофанот е есенцијална амино киселина која ја добиваме целосно од храната.Заклучуваме дека намалувањето на серумскиот триптофан кај аденокарцином на белите дробови може да го одрази брзото намалување на овој метаболит.Добро е познато дека крајниот производ на катаболизмот на триптофан преку кинуренинската патека е изворот на de novo NAD+ синтезата.Бидејќи NAD+ се произведува првенствено преку спасувачкиот пат, важноста на NAD+ во метаболизмот на триптофан во здравјето и болеста останува да се утврди46.Нашата анализа на базата на податоци TCGA покажа дека изразот на транспортерот на триптофан растворувач на растворени материи 7A5 (SLC7A5) беше значително зголемен кај аденокарцином на белите дробови во споредба со нормалните контроли и беше позитивна корелација со изразувањето на гликолитичкиот ензим GAPDH.Претходните студии главно се фокусираа на улогата на катаболизмот на триптофан во потиснување на антитуморниот имунолошки одговор40,41,42.Овде покажуваме дека инхибицијата на навлегувањето на триптофан со соборување на SLC7A5 во клетките на ракот на белите дробови резултира со последователно намалување на клеточните нивоа на NAD и истовремено слабеење на гликолитичката активност.Накратко, нашата студија обезбедува биолошка основа за промените во серумскиот метаболизам поврзани со малигната трансформација на аденокарцином на белите дробови.
EGFR мутациите се најчестите мутации на двигател кај пациенти со NSCLC.Во нашата студија, откривме дека пациентите со мутација на EGFR (n = 41) имаат севкупни метаболомски профили слични на пациентите со EGFR од див тип (n = 31), иако откривме намалени серумски нивоа на некои пациенти со EGFR-мутан кај пациенти со ацилкарнитин.Воспоставената функција на ацилкарнитините е да транспортираат ацилни групи од цитоплазмата во митохондријалната матрица, што доведува до оксидација на масните киселини за производство на енергија 55 .Во согласност со нашите наоди, една неодамнешна студија исто така идентификуваше слични профили на метаболи помеѓу EGFR мутантот и EGFR туморите од див тип преку анализа на глобалниот метаболом на 102 примероци на ткиво на белодробен аденокарцином50.Интересно, содржината на ацилкарнитин беше пронајдена и во групата мутант EGFR.Затоа, дали промените во нивоата на ацилкарнитин ги одразуваат метаболичките промени предизвикани од EGFR и основните молекуларни патишта може да заслужуваат понатамошно проучување.
Како заклучок, нашата студија воспоставува серумски метаболички класификатор за диференцијална дијагноза на пулмоналните јазли и предлага работен тек кој може да ја оптимизира проценката на ризикот и да го олесни клиничкото управување врз основа на скрининг со КТ скен.
Оваа студија беше одобрена од Етичкиот комитет на Универзитетската болница за рак Сун Јат-сен, Првата поврзана болница на Универзитетот Сун Јат-сен и Етичкиот комитет на Универзитетската болница за рак во Женгжу.Во групите за откривање и интерна валидација, 174 серуми од здрави индивидуи и 244 серуми од бенигни јазли беа собрани од лица кои беа подложени на годишни медицински прегледи на Одделот за контрола и превенција на рак, Универзитетскиот центар за рак на Сун Јат-сен и 166 бенигни нодули.серум.Белодробните аденокарциноми во стадиум I беа собрани од Центарот за рак на Универзитетот Сун Јат-сен.Во групата за надворешна валидација, имаше 48 случаи на бенигни нодули, 39 случаи на аденокарцином на белите дробови во стадиум I од Првата поврзана болница на Универзитетот Сун Јат-сен и 24 случаи на аденокарцином на белите дробови во I фаза од болницата за рак во Женгжу.Сун Јат-сен Универзитетскиот центар за рак, исто така, собра 16 случаи на стадиум на сквамозен карцином на белите дробови за да ја тестира дијагностичката способност на воспоставениот метаболички класификатор (карактеристиките на пациентот се прикажани во дополнителна табела 5).Примероците од групата за откривање и внатрешната група за валидација беа собрани помеѓу јануари 2018 и мај 2020 година. Примероците за надворешната група за валидација беа собрани помеѓу август 2021 и октомври 2022 година. За да се минимизира родовата пристрасност, приближно еднаков број машки и женски случаи беа доделени на секој група.Тим за откривање и тим за внатрешен преглед.Полот на учесникот беше одреден врз основа на самопријавување.Беше добиена информирана согласност од сите учесници и не беше обезбеден надоместок.Субјектите со бенигни нодули беа оние со стабилен резултат на КТ скен на 2 до 5 години во времето на анализата, освен 1 случај од примерокот за надворешна валидација, кој беше собран предоперативно и дијагностициран со хистопатологија.Со исклучок на хроничен бронхитис.Случаите со аденокарцином на белите дробови беа собрани пред ресекција на белите дробови и потврдени со патолошка дијагноза.Примероците на крв на гладно беа собрани во серумски сепарациони цевки без никакви антикоагуланси.Примероците на крвта беа згрутчувани 1 час на собна температура и потоа центрифугирани на 2851 × g 10 минути на 4 ° C за да се собере серумскиот супернатант.Серумските делови беа замрзнати на -80°C до екстракција на метаболитот.Одделот за превенција на рак и медицински преглед на Универзитетскиот центар за канцер Сун Јат-сен собра серум од 100 здрави донатори, вклучително и еднаков број мажи и жени на возраст од 40 до 55 години.Беа измешани еднакви волумени од секој примерок од донаторот, добиениот бензин беше аликвотиран и складиран на -80°C.Серумската смеса се користеше како референтен материјал за контрола на квалитетот и стандардизација на податоците.
Референтниот серум и примероците за тестирање беа одмрзнати, а метаболитите беа екстрахирани користејќи комбинирана метода на екстракција (MTBE/метанол/вода) 56 .Накратко, 50 μl серум се измешани со 225 μl леден метанол и 750 μl ледено ладен метил терц-бутил етер (MTBE).Промешајте ја смесата и инкубирајте на мраз 1 час.Примероците потоа беа измешани и измешани со вртлог со 188 μl MS-класа вода што содржи внатрешни стандарди (13C-лактат, 13C3-пируват, 13C-метионин и 13C6-изолеуцин, купени од Cambridge Isotope Laboratories).Смесата потоа беше центрифугирана на 15.000 × g за 10 минути на 4 °C, а долната фаза беше префрлена во две цевки (по 125 μL) за LC-MS анализа во позитивен и негативен режим.Конечно, примерокот беше испаруван до суво во вакуумски концентратор со голема брзина.
Исушените метаболити беа реконституирани во 120 μl од 80% ацетонитрил, вртлог 5 мин и центрифугирани на 15.000 × g 10 мин на 4°C.Супернатантите беа префрлени во килибарно стаклени ампули со микроинсерти за метаболички студии.Нетаргетирана метаболомична анализа на платформа со ултра-перформансна течна хроматографија-масена спектрометрија со висока резолуција (UPLC-HRMS).Метаболитите беа одвоени со помош на системот Dionex Ultimate 3000 UPLC и ACQUITY BEH Amide колона (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Водите).Во режим на позитивен јонски режим, мобилните фази беа 95% (А) и 50% ацетонитрил (Б), секоја содржи 10 mmol/L амониум ацетат и 0,1% мравја киселина.Во негативен режим, мобилните фази А и Б содржеа 95% и 50% ацетонитрил, соодветно, двете фази содржеа 10 mmol/L амониум ацетат, pH = 9. Градиентната програма беше следна: 0-0,5 мин, 2% B;0,5-12 мин, 2-50% Б;12-14 мин, 50-98% Б;14-16 мин, 98% Б;16-16.1.мин, 98 -2% Б;16,1-20 мин, 2% B. Колоната се одржуваше на 40°C, а примерокот на 10°C во автосемплерот.Стапката на проток беше 0,3 ml/min, волуменот на инјектирање беше 3 μl.Масен спектрометар Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) со извор на јонизација со електроспреј (ESI) беше управуван во режим на целосно скенирање и споен со режимот за следење ddMS2 за да се соберат големи количини на податоци.Параметрите на MS беа поставени на следниов начин: напон на прскање +3,8 kV/- 3,2 kV, капиларна температура 320°C, заштитен гас 40 arb, помошен гас 10 arb, температура на грејачот на сонда 350°C, опсег на скенирање 70–1050 m/h, резолуција.70 000. Податоците се добиени со помош на Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
За да се процени квалитетот на податоците, здружените примероци за контрола на квалитетот (QC) беа генерирани со отстранување на делови од 10 μL од супернатантот од секој примерок.Шест инјекции на примерок за контрола на квалитетот беа анализирани на почетокот на аналитичката секвенца за да се процени стабилноста на системот UPLC-MS.Примероците за контрола на квалитетот потоа периодично се внесуваат во серијата.Сите 11 серии серумски примероци во оваа студија беа анализирани со LC-MS.Делови од мешавина од серумски базен од 100 здрави донатори беа користени како референтен материјал во соодветните серии за следење на процесот на екстракција и прилагодување за ефектите од серија до серија.Во Метаболомскиот центар на Универзитетот Сун Јат-сен беше извршена нетаргетирана метаболомична анализа на групата за откривање, внатрешната група за валидација и надворешната група за валидација.Надворешната лабораторија на Центарот за анализа и тестирање на Универзитетот за технологија Гуангдонг, исто така, анализирала 40 примероци од надворешната група за да ги тестира перформансите на моделот на класификаторот.
По екстракција и реконституција, апсолутната квантитација на серумските метаболити беше измерена со употреба на масена спектрометрија со ултра високи перформанси течна хроматографија-тандем (Agilent 6495 троен четирипол) со извор на јонизација со електроспреј (ESI) во режим на повеќекратна реакција (MRM).Колона ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) беше искористена за одвојување на метаболитите.Мобилната фаза се состоеше од 90% (А) и 5% ацетонитрил (Б) со 10 mmol/L амониум ацетат и 0,1% раствор на амонијак.Градиентната програма беше следна: 0–1,5 мин, 0% Б;1,5-6,5 мин, 0-15% Б;6,5-8 мин, 15% Б;8-8,5 мин, 15%-0% Б;8,5-11,5 мин, 0% Б.Колоната се одржуваше на 40 °C, а примерокот на 10 °C во автосемплерот.Стапката на проток беше 0,3 mL/min, а волуменот на инјектирање беше 1 μL.Параметрите на MS беа поставени на следниов начин: капиларен напон ±3,5 kV, притисок на небулизаторот 35 psi, проток на гас на обвивката 12 L/min, температура на гасот на обвивката 350°C, температура на гасот за сушење 250°C и проток на гас за сушење 14 l/min.МРМ конверзиите на триптофан, пируват, лактат, хипоксантин и ксантин беа 205,0-187,9, 87,0-43,4, 89,0-43,3, 135,0-92,3 и 151,0-107.9 соодветно.Податоците беа собрани со помош на Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).За серумските примероци, триптофан, пируват, лактат, хипоксантин и ксантин беа квантифицирани со користење на криви за калибрација на стандардни раствори од смеса.За клеточните примероци, содржината на триптофан беше нормализирана на внатрешниот стандард и масата на клеточниот протеин.
Врвната екстракција (m/z и време на задржување (RT)) беше изведена со користење на Compound Discovery 3.1 и TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).За да се елиминираат потенцијалните разлики помеѓу сериите, секој карактеристичен врв на тест примерокот беше поделен со карактеристичниот врв на референтниот материјал од истата серија за да се добие релативното изобилство.Релативните стандардни отстапувања на внатрешните стандарди пред и по стандардизацијата се прикажани во дополнителната табела 6. Разликите помеѓу двете групи се карактеризираа со стапка на лажно откривање (FDR<0,05, тест за ранг со потпишан Wilcoxon) и промена на пати (>1,2 или <0,83).Необработените податоци за MS за извлечените карактеристики и референтните серумски корегирани податоци за MS се прикажани во Дополнителни податоци 1 и Дополнителни податоци 2, соодветно.Врвната прибелешка беше изведена врз основа на четири дефинирани нивоа на идентификација, вклучувајќи идентификувани метаболити, наводно забележани соединенија, наводно карактеризирани класи на соединенија и непознати соединенија 22 .Врз основа на пребарувањата во базата на податоци во Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), биолошките соединенија со MS/MS кои одговараат на потврдените стандарди или точното совпаѓање прибелешки во mzCloud (оценка > 85) или Chemspider конечно беа избрани како посредници помеѓу диференцијалниот метаболом.Врвните прибелешки за секоја карактеристика се вклучени во Дополнителни податоци 3. MetaboAnalyst 5.0 беше користен за униваријатна анализа на изобилството на метаболити нормализирано со сума.MetaboAnalyst 5.0, исто така, ја процени анализата на збогатување на патеката KEGG врз основа на значително различни метаболити.Анализата на главна компонента (PCA) и анализата за дискриминација на парцијални најмали квадрати (PLS-DA) беа анализирани со користење на софтверскиот пакет ropls (v.1.26.4) со нормализација на стек и автоматско скалирање.Оптималниот модел на биомаркер на метаболит за предвидување на малигнитет на јазлите беше генериран со користење на бинарна логистичка регресија со најмалку апсолутно смалување и оператор за селекција (LASSO, R пакет v.4.1-3).Перформансите на моделот за дискриминација во комплетите за откривање и валидација се карактеризираа со проценка на AUC врз основа на ROC анализа според пакетот pROC (v.1.18.0.).Оптималниот прекин на веројатноста е добиен врз основа на максималниот Youden индекс на моделот (чувствителност + специфичност – 1).Примероците со вредности помали или поголеми од прагот ќе бидат предвидени како бенигни нодули и белодробен аденокарцином, соодветно.
Клетките A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) беа одгледувани во медиум F-12K што содржи 10% FBS.Во лентивирусниот вектор pLKO.1-пуро беа вметнати кратки секвенци на РНК (shRNA) на шноли кои таргетираат SLC7A5 и нетаргетирана контрола (NC).Антисензните секвенци на shSLC7A5 се како што следува: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Антителата на SLC7A5 (#5347) и тубулин (#2148) беа купени од Технологијата за сигнализација на клетките.Антителата на SLC7A5 и тубулин беа користени со разредување од 1:1000 за анализа на Western blot.
Гликолитичкиот стрес тест на Seahorse XF ги мери нивоата на екстрацелуларна закиселување (ECAR).Во анализата, гликозата, олигомицин А и 2-DG беа администрирани последователно за да се тестира клеточниот гликолитички капацитет како што се мери со ECAR.
Клетките A549 трансфектирани со нетаргетирана контрола (NC) и shSLC7A5 (Sh1, Sh2) беа поставени преку ноќ во чинии со дијаметар од 10 cm.Клеточните метаболити беа екстрахирани со 1 ml ледено 80% воден метанол.Клетките во растворот на метанол беа изгребани, собрани во нова цевка и центрифугирани на 15.000 × g за 15 минути на 4 ° C.Соберете 800 µl супернатант и исушете со помош на вакумски концентратор со голема брзина.Исушените метаболитни пелети потоа беа анализирани за нивоа на триптофан користејќи LC-MS/MS како што е опишано погоре.Нивоата на клеточниот NAD(H) во ќелиите A549 (NC и shSLC7A5) беа измерени со користење на квантитативен колориметриски комплет NAD+/NADH (#K337, BioVision) според упатствата на производителот.Нивоата на протеини беа измерени за секој примерок за да се нормализира количеството на метаболити.
Не беа користени статистички методи за прелиминарно одредување на големината на примерокот.Претходните метаболички студии насочени кон откривање на биомаркери15,18 беа земени предвид како одредници за одредување на големината, и во споредба со овие извештаи, нашиот примерок беше соодветен.Ниту еден примерок не беше исклучен од испитуваната група.Серумските примероци беа случајно доделени на група за откривање (306 случаи, 74,6%) и група за внатрешна валидација (104 случаи, 25,4%) за нетаргетирани метаболомични студии.Исто така, по случаен избор избравме 70 случаи од секоја група од сет на откритија за целни метаболомични студии.Истражувачите беа заслепени за групна задача за време на собирањето и анализата на податоците од LC-MS.Статистичките анализи на метаболичките податоци и клеточните експерименти се опишани во соодветните секции Резултати, Легенди за слики и Методи.Квантификацијата на клеточниот триптофан, NADT и гликолитичката активност беше изведена три пати независно со идентични резултати.
За повеќе информации за дизајнот на студијата, видете го Апстрактот за Извештај за природно портфолио поврзан со овој напис.
Необработените податоци за MS од извлечените карактеристики и нормализираните MS податоци на референтниот серум се прикажани во Дополнителни податоци 1 и Дополнителни податоци 2, соодветно.Врвните прибелешки за диференцијалните карактеристики се претставени во Дополнителни податоци 3. Базата на податоци на LUAD TCGA може да се преземе од https://portal.gdc.cancer.gov/.Влезните податоци за исцртување на графикот се дадени во изворните податоци.Изворните податоци се дадени за овој напис.
Национална студиска група за скрининг на белите дробови, итн. Намалување на смртноста од рак на белите дробови со компјутерска томографија со мала доза.Северна Англија.J. Med.365, 395-409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR and Prophet, PC Скрининг за рак на белите дробови со употреба на спирален КТ со ниски дози: резултати од Националната студија за скрининг на белите дробови (NLST).J. Med.Екран 18, 109–111 (2011).
Де Конинг, ХЈ и сор.Намалување на смртноста од рак на белите дробови со волуметриски КТ скрининг во рандомизирано испитување.Северна Англија.J. Med.382, 503-513 (2020).
Време на објавување: 18-ти септември 2023 година