Кластерираните редовно распоредени кратки палиндромски повторувања (CRISPR) е техника за уредување на геноми од трета генерација која го револуционизираше светот со своите резултати со висок проток. Се користи за лекување на разни биолошки болести и инфекции. Различни бактерии и други прокариоти (како што се археите) исто така имаат CRISPR/Cas9 системи за одбрана од фаги. Објавено е дека стратегиите базирани на CRISPR/Cas9 можат да го инхибираат растот и прогресијата на тројно негативниот рак на дојка (TNBC) со таргетирање на потенцијално изменетите гени за отпорност, транскрипцијата и епигенетската регулација. Овие терапевтски интервенции можат да помогнат во решавањето на предизвикувачките проблеми како што е отпорноста на лекови забележана дури и кај TNBC. Во моментов, се користат различни методи за испорака на CRISPR/Cas9 до целните клетки, како што се физички (микроинјекција, електропорација и хидродинамички режими), вирусни (адено-поврзан вирус и лентивирус) и невирусни (липозоми и липидни наночестички). Иако се развиени различни модели за проучување на молекуларните причини за TNBC, недостатокот на чувствителни и насочени методи за испорака на алатки за уредување на геном in vivo ја ограничува нивната клиничка примена. Накратко, овој преглед сеопфатно ги испитува напредокот, предизвиците, ограничувањата и перспективите на третманот на TNBC со CRISPR/Cas9 врз основа на постојните докази. Исто така, истакнуваме како комбинацијата од вештачка интелигенција и машинско учење може да ги подобри стратегиите на CRISPR/Cas9 во третманот на TNBC.
Ракот се карактеризира со неконтролирана клеточна делба, нарушување на контролните точки на клеточниот циклус и мутации во гените за супресор на туморот (TSG) (Matthews et al., 2022). Меѓу различните видови на рак, ракот на дојка е најчестиот вид рак кај жените и има висока стапка на смртност во светот (Waks and Winer, 2019). Ракот на дојка е хетерогена болест со разновидни карактеристики, како што се хистолошки и биолошки карактеристики, клиничка презентација и однесување и одговор на третман (Weigelt et al., 2010). Класификацијата на ракот на дојка дава прецизни сознанија за дијагноза на рак на дојка и прогноза на тумор. Употребата на вообичаени биомаркери и клиничко-патолошки карактеристики е главен критериум за класификација на ракот на дојка (Tsang and Tse, 2019). Прогнозата и одговорот на третманот на ракот на дојка се под влијание на бројни фактори, вклучувајќи го присуството на естрогенски рецептор (ER), прогестеронски рецептор (PR), човечки епидермален фактор на раст рецептор 2 (HER2/neu) и хистолошки степен, тип на тумор и степен. големина и метастази во лимфните јазли (Al-Tubaiti, 2020). Идентификувани се пет интринзични молекуларни подтипови на рак на дојка, вклучувајќи луминален А, луминален Б, HER2-збогатен, базално-сличен и клаудин-низок (Prat et al., 2015). TNBC е молекуларен подтип на рак кој не ги експресира сите ER, PR и HER2 (Yin et al., 2020). Овие патолошки карактеристики се поврзани со TNBC, потврдувајќи ја неговата брза прогресија и поагресивна природа од кој било друг вид рак на дојка (Feng et al., 2018). Дополнително, Peru et al (2000) користеле микрочип технологија за рекласифицирање на ракот на дојка и идентификување на пет интринзични подтипови на рак на дојка (Cadenas, 2012). Базално-сличен рак на дојка е подтип на рак на дојка кој има тројно негативен фенотип и е поврзан со брза прогресија. Треба да се напомене дека сите базално-слични карциноми на дојка најчесто се погрешно дијагностицирани како TNBC, но само 77% се TNBC; Спротивно на тоа, 71–91% од TNBC се базално-слични, што укажува дека овие два вида на рак на дојка се преклопуваат и претставуваат различни класификации (Wang D.-Y. et al., 2019). Ова создава потреба да се карактеризира хетерогеноста на TNBC за да се разјасни прогнозата и да се идентификуваат потенцијалните одговори на тековните и идните третмани. Дополнително, TNBC учествува со 15–20% од сите случаи на рак на дојка и е почест кај жени под 50 години. Мутации BRCA1 или BRCA2 се пријавени кај приближно 20% од случаите на TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). , 2020). Студиите, исто така, покажаа дека TNBC има посебна имунолошка микросредина која вклучува високи нивоа на васкуларни ендотелијални фактори на раст, макрофаги поврзани со тумор (TAM), лимфоцити кои инфилтрираат тумор (TIL) и други молекули вклучени во растот и миграцијата на туморот. Затоа, разбирањето на микросредината на TNBC е клучно за неговата прогноза и третман (Fan and He, 2022).
За да се процени прогнозата на TNBC и да се обезбеди ефикасен третман, важна е точната дијагноза, главно базирана на имунохистохемија (IHC) за откривање на ER, PR и HER2, и мамографија за откривање на неоплазми на дојка. Сепак, мамографијата не може соодветно да ги прикаже интратуморалните карактеристики како што се некроза и фиброза (Deepak Singh et al., 2021). Бидејќи лошата прогноза и дијагноза ги спречуваат лекарите да ги препишат вистинските лекови (Chaudhary, 2020), се користат различни стратегии за подобрување на грижата за пациентите со TNBC. Во моментов, два лека, доксорубицин и циклофосфамид, се користат кај пациенти со TNBC и покажаа добри резултати. Покрај тоа, се користат и други платински лекови, како што се карбоплатин и цисплатин (Sikov et al., 2015). Покрај тоа, PARP инхибиторите како што се Olaparib, Velaparib и PF-01367338 се користат како потенцијални хемотерапевтски лекови за третман на TNBC (Ishino et al., 2018). Бидејќи е објавено дека сигналните патишта Wnt/b-Catenin, NOTCH и Hedgehog се вклучени во појавата и прогресијата на TNBC, насочувањето на лековите кон овие патишта може да биде важна стратегија (Aysola et al., 2013). Иако хирургијата, радиотерапијата и хемотерапијата остануваат главни столбови на третманот за TNBC денес, постигнат е значителен напредок во развојот на нови третмани, вклучувајќи таргетирана терапија, имунотерапија, разни алатки за уредување на гени поврзани со CRISPR, како што се Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, prime уредување и генска терапија насочена кон CRISPR/Cas9. Овде ќе се фокусираме на различни алатки за уредување на гени поврзани со CRISPR што се користат во третманот на TNBC. Меѓу нив, CRISPR/Cas9 доби широко внимание.
Cas9n, исто така познат како Cas9 никаза, е генетски модифицирана варијанта на протеинот Cas9 добиена од системот за уредување на геномот CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). Во својата оригинална форма, протеинот Cas9 содржи два нуклеазни домени: RuvC и HNH, чија главна функција е раскинување на двата ДНК нишки. Сепак, кај Cas9n, еден од нуклеазните домени, HNH, е генетски мутиран и станува неактивен. Затоа, доменот HNH на Cas9n останува нефункционален. Само доменот RuvC останува активен, дозволувајќи му на Cas9n да сече или да создава прекини на единечни ДНК нишки (Trevino and Zhang, 2014). Во споредба со Cas9, Cas9n може ефикасно да ги намали ефектите надвор од целта и прецизно да ги подобри механизмите за поправка на клетките. Cas9n може да се користи за решавање на разни проблеми, како што е создавање прекини на специфични локации во двоверижна ДНК. За таа цел, два молекули Cas9n беа комбинирани и користени заедно (Yee, 2016). Мешаната лоза киназа 3 (MLK3) е протеинска киназа активирана од митоген која служи како клучен регулатор за време на метастазите на TNBC (Cronan et al., 2012).
MLK3 може да активира повеќе сигнални патишта што водат до метастази на TNBC. На пример, патеката c-Jun N-терминална киназа (JNK) ја регулира подвижноста на клетките и деградацијата на екстрацелуларниот матрикс, а MLK3 го активира JNK патот, со што ја подобрува подвижноста на клетките и дава инвазивни својства (Rattanasinchai and Gallo, 2016). MLK3, исто така, го регулира EMT. За да го направи ова, ги активира факторите на транскрипција низводно како што се Snail, Slug и Twist. Овие фактори ја инхибираат експресијата на епителните маркери и ја промовираат експресијата на мезенхималните маркери, што доведува до стекнување на метастатски фенотип (Casalino et al., 2023). Забележано е дека MLK3 игра улога во ремоделирањето на ECM и активирањето на протеази како што се матрикс металопротеиназите (MMPs) кои го деградираат ECM. Ова го олеснува инвазијата на туморските клетки и ширењето на далечни места (Katari et al., 2019). Така, претходните студии покажаа дека MLK3 игра клучна улога во TNBC. Ратанасинчаи и Гало користеле TNBC модели за да ја проучат улогата на MLK3 и откриле дека тој го поттикнува развојот на ракот преку специфични сигнални патишта. Тие користеле CRISPR/Cas9n за да го модифицираат MLK3 и забележале значително намалување на метастазите на TNBC (Rattanasinchai и Gallo, 2016).
dCas9, често наречен неактивен Cas9, е модифицирана дериватна форма на протеинот Cas9. За разлика од активниот Cas9, dCas9 нема ендонуклеазна активност, што го прави неспособен да предизвика прекини на двојната низа на ДНК. Затоа, dCas9 може да се користи за прецизно таргетирање на специфични региони на геномот без никакви промени или модификации на ДНК секвенцата (Wang et al., 2016). Во dCas9, два ендонуклеазни протеини, RuvC и HNH, се инактивираат со супресија на важни аминокиселински остатоци. (Richter et al., 2016). И покрај недостатокот на активност на расцепување на ДНК, dCas9 игра голем број важни улоги во генетските истражувања и биотехнологијата. На пример, овозможува визуелизација на специфични региони на геномот, го олеснува транскрипциското регулирање и ги промовира епигенетските модификации (Brocken et al., 2018).
Транскрипцискиот фактор ZEB1 (хомеобокс 1 за врзување на E-кутија со цинк прст) игра специфична и критична улога во посредувањето на епително-мезенхималната транзиција (EMT), клеточен процес што се јавува за време на ембрионалниот развој, поправката на ткивата и прогресијата на ракот. Тој вклучува трансформација на епителните клетки во мезенхимални клетки, што резултира со промени во морфологијата, подвижноста, инвазивноста на клетките итн. (Wu et al., 2020). ZEB1 инхибира повеќе епителни маркери, како што се E-кадхерин и Occludin, кои се одговорни за одржување на адхезијата помеѓу клетките и поларитетот на епителните клетки во TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Покрај тоа, ZEB1 активира одредени маркери како што се N-кадхерин, виментин и фибронектин (Konradi et al., 2014), а исто така ги регулира и гените вклучени во цитоскелетното ремоделирање, како што се Rho GTPазите и матриксните металопротеинази (MMPs) (Huang). et al., 2014). 2022), покрај тоа, влијае и на различни сигнални патишта како што се трансформирачкиот фактор на раст-β (TGF-β), Wnt сигнализацијата итн., со што се промовира инвазија на тумор и метастази во TNBC (Chen et al., 2016). Бројни студии и научни докази укажуваат дека ZEB1 има голем потенцијал како вреден агенс за откривање и терапевтска интервенција на TNBC. Во неодамнешна студија, Waryah et al. користеле TNBC модел и постигнале целосна супресија на ZEB1 со dCas9. Така, тие забележале многу висока специфичност и речиси целосна инхибиција на ZEB1 во in vivo услови (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 е алатка за уредување гени наречена CRISPR/Cpf1. Изведена е од системот CRISPR/Cas, каде што терминот Cas12 се однесува на протеинот 12 поврзан со CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), кој е целосно сличен на Cas9. Единствената разлика е во тоа што го содржи протеинот Cas12. Во споредба со Cas9, Cas12 има некои уникатни функции како што е генерирање лепливи краеви за време на процесот на уредување на гени, додека Cas9 генерира тапи краеви (Wang et al., 2021). Ова својство на Cas12 придонесува за неговата специфична технологија за манипулација со ДНК. Како протеин способен прецизно да ја препознава и сече целната ДНК, тој има извонредна разновидност, што го прави ефикасна алатка за различни апликации, вклучително и уредување на гени (Pickar-Oliver and Gersbach, 2019).
Слично на другите варијанти на CRISPR, CRISPR/Cas12 е способен и за нокаутирање или активирање на гени во TNBC, таргетирајќи гени кои играат важна улога во неговата патогенеза или одговор на третман (Yang and Zhang, 2023). За да се постигне овој процес, развиена е водичска РНК (gRNA) која го насочува Cas12 кон целниот ген. Откако Cas12 ќе се врзе за својата цел, тој воведува двојни прекини во ДНК и ги активира механизмите за поправка на ДНК. За време на процесот на поправка, може да се инкорпорираат неточни нуклеотиди, што доведува до генски мутации и губење на функцијата (Zhang et al., 2021a). Покрај тоа, подобрена верзија на ензимот Cas12 (наречен dCas12) беше користена и за активирање на гените. Со комбинирање со активатор на транскрипција, можно е да се индуцираат одредени гени, со што се активираат. Оваа технологија има голем потенцијал во промовирањето на активирањето на гени за супресија на тумор (Sultan et al., 2022).
Prime уредувањето е новоразвиена и исклучително супериорна технологија за уредување на геном. Таа е способна многу прецизно да ја модифицира ДНК-та на организмот (Chen and Liu, 2023). Prime уредувањето се постигнува преку интеграција на две главни компоненти: модифициран ензим CRISPR/Cas9 и обратна транскриптаза. Улогата на ензимот CRISPR/Cas9 е селективно да ги таргетира прецизните места во геномот, додека обратната транскриптаза помага темелно да се модифицира ДНК-та на целната локација (Hassan et al., 2021). Во механизмот за уредување на прајмери, првиот чекор вклучува создавање на РНК водич за уредување на прајмери (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Таа содржи целна секвенца и РНК шаблон што одговара на посакуваното место за уредување во целната ДНК. PegRNA потоа се воведува во целните клетки заедно со нуклеаза за уредување на прајмери (PE2). PE2 е фузиониран протеин кој се состои од ензим Cas9, обратна транскриптаза и адаптер за уредување на прајмери (Martín-Alonso et al., 2021). Внатре во клетката, pegRNA и PE2 комплексите ја бараат специфичната ДНК што сакаат да ја модифицираат. Ензимот Cas9 ја сече ДНК и создава шаблон што се состои од единечни нишки (Choi et al., 2022). Обратната транскриптаза го користи овој шаблон за да ја подготви ДНК за уредување. Заедно со копирањето на ДНК, вклучени се и упатства за уредување на шаблонот на РНК. Конечно, новосоздадената ДНК нишка се користи како шаблон за поправка на прекинот во ДНК, што резултира со изменета ДНК секвенца што ја содржи посакуваната модификација (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Механизмите за уредување на прајмери можат да доведат до широко распространети мутации во гените. Може да таргетира точкести мутации, вметнувања, делеции, па дури и замена на гени (Anzalone et al., 2019; Chen and Liu, 2023). Прајм уредувањето нуди неколку предности во однос на претходните технологии за уредување на геном. Тие вклучуваат зголемена точност, намалени ефекти надвор од целта и можност за уредување на ДНК без потпирање на прекини на двојната нишка на ДНК (Anzalone et al., 2020).
Технологијата CRISPR/Cas9 првично беше развиена за заштита на бактериите од плазмиден трансфер и фажна инфекција, а подоцна беше пренаменета како ефикасна алатка за таргетирање на ДНК базирана на РНК за уредување на геномот (Jiang and Doudna, 2017). Покрај тоа, е објавено дека системот CRISPR/Cas9 е присутен во 50% и 87% од бактериските и архејските геноми, соодветно (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 е потенцијална алатка за бришење, вметнување и корекција на која било абнормална генетска секвенца со користење на in vivo и in vitro режими (Sabit et al., 2021). Покрај тоа, се покажа дека CRISPR/Cas9 е дел од адаптивниот имунолошки систем поради неговата специфичност за целните гени од интерес (Chen and Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 се состои од Cas9 и една РНК водич (sgRNA). Cas9 е ендонуклеаза составена од повеќе протеински компоненти. Покрај тоа, Cas9 има уникатни структурни и конформациски својства (Pacesa et al., 2022) бидејќи се состои од два лобуса: препознавање (REC) и нуклеаза (NUC). Лобусот REC е понатаму поделен на три региони: REC1, REC2 и мостови спирали (Cromwell et al., 2018). NUC се состои од три лобуси, имено RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH и доменот на интеракција со соседниот мотив на протоспејсерот (PAM) (Сл. 1) (Song et al., 2016). sgRNA се состои од две компоненти, вклучувајќи CRISPR РНК (crRNA) и транскодирање на мала РНК (трасерска РНК) (Слика 1). sgRNA го поврзува протеинот Cas9 со конексините за да формира активен комплекс, познат и како ефекторски комплекс (Richter et al., 2012). crRNA е базен пар од 18-20 нуклеотиди кој игра клучна улога во препознавањето на целните ДНК секвенци. Покрај тоа, crRNA се спарува со целната ДНК, а tracrRNA делува како скеле за Cas9 нуклеазата да се врзе со целната ДНК (Manghwar et al., 2019). Од друга страна, PAM секвенцата има 3 нуклеотиди, што го потврдува, специфицира и посредува врзувањето на ефекторскиот комплекс со ДНК. Под-единиците на протеинскиот комплекс Cas9, RuvC и HNH, имаат каталитичка активност (Richter et al., 2012; Asmamaw и Zawdie, 2021). Доменот на нуклеаза HNH на под-единицата Cas9 го раскинува ДНК ланец поврзан со crRNA. Доменот на нуклеаза RuvC ги сече другите ДНК нишки и генерира двојни прекини на нишките (DSB), по што се активираат два различни механизми за поправка на прекините на ДНК (Jiang and Doudna, 2017) (Слика 1).
Слика 1. Преглед на CRISPR/Cas9 (A). Компоненти на системот CRISPR/Cas9: (i). Cas9 ендонуклеазата е одговорна за сечење на целната ДНК секвенца, (ii) единечна водилка (sg) РНК што произлегува од фузијата на crRNA и tra-crRNA химери. (две). Cas9 вклучува неколку компоненти како што се Rec I, Rec II, NUC лобус (HNH и Ruv C се подкомпоненти) и PAM интеракциски домен (C) со соодветни функции. Протеинскиот комплекс CRISPR/Cas9 ги разложува ДНК секвенците во некомплементарни и комплементарни форми (D). CRISPR/Cas9 го уредува геномот во три фази: препознавање, сечење и поправка. Дизајнираната sg-РНК го води Cas9 и ја препознава посакуваната секвенца преку комплементарната компонента crRNA. Cas9 ја препознава PAM секвенцата на 5′-NGG-3′ и ја топи ДНК, формирајќи хибрид на ДНК-РНК и активирајќи го расцепувањето. HNH доменот на Cas9 го сече комплементарниот ланец, а RuvC доменот го сече некомплементарниот ланец. CRISPR/Cas9 ја поправа dsDNA со нејзино кршење на два начина: нехомологно спојување на краевите (NHEJ) и поправка насочена кон хомологија (HDR). NHEJ ја поправа двоверижната ДНК во отсуство на туѓа хомологна ДНК преку ензимски процес, механизам склонен кон грешки кој може да вметне или отстрани случајни ДНК секвенци. HDR е многу специфичен и бара хомологни ДНК шаблони.
CRISPR/Cas9-посредуваните патишта за поправка вклучуваат механизми за нехомологно спојување на краевите (NHEJ) и поправка насочена кон хомологија (HDR). NHEJ е патека склона кон грешки бидејќи вклучува вметнување или бришење и не бара никаков модел за време на механизмот за поправка. Користи случајни нуклеотиди за генерирање стандардни протеини (Abbasi et al., 2021). Овој систем за поправка се состои од четири комплекси како што се KU комплексот, вкрстено-комплементарниот протеински комплекс тип 4 (XRCC-4), ензимот за обработка на краевите на ДНК и протеинската киназа DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Комплексот протеин KU има две подединици, Ku 70 и Ku 80, и игра важна улога во механизмот NHEJ, бидејќи механизмот за поправка е инициран со врзување на две подединици (Ku 70 и Ku 80) за тапите или речиси тапите краеви на целната ДНК (Abbasi et al., 2021), служејќи како скеле за регрутирање на други фактори поврзани со NHEJ на местото на повреда (Yang et al., 2020). XRCC-4 и ДНК лигазата се составени од 334 и 911 аминокиселини, соодветно, а комплексот XRCC4-ДНК лигаза IV ја стимулира лигацијата на краевите на ДНК (Chatterjee et al., 2015). Ензимот за обработка на краевите на ДНК, познат и како полинуклеотидна киназа 3′-фосфат, е ензим за обработка на краевите на ДНК. Може да ја отстрани 3′P групата во ДНК и да ја фосфорилира 5′OH групата за време на поправката на DSB. Исто така, вклучува поправка на прекини на едноверижни нишки (SSB) со користење на патеката за поправка на SSB (Chatterjee et al., 2015). Протеинската киназа DNA-PKcs е ДНК-зависна протеинска киназа која се состои од каталитичка под-единица на семејството PIKKs (фосфатидилинозитол 3-киназа-поврзани кинази) и атаксија-телеангиектазија мутирани (ATM), како и ATR поврзани со ATM и Rad3, прекини на нишки (DSB) и прекини на едноверижни нишки (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR е попрецизен и посоодветен механизам за поправка бидејќи информациите се копираат со користење на интактната форма на хомологниот ДНК дуплекс, иако тоа бара присуство на сестрински хроматиди. Ова се случува за време на S/G2 фазата од клеточниот циклус кај цицачите. HDR се јавува главно кај видовите квасец, но NHEJ е критичен кај цицачите (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Целосниот механизам за поправка е прикажан на Слика 1.
Бидејќи TNBC е предизвикан од генетски и епигенетски абнормалности, корекцијата на малигните геномски/епигеномски абнормалности со користење на CRISPR/Cas9 може да биде разумен терапевтски пристап (Chen et al., 2019). Покрај тоа, некои транскрипциони фактори вклучени во транскрипциската регулација специфична за клетките може да покажат уникатни карактеристики на клетките на ракот, што сугерира дека транскрипциската регулација може да биде одличен пристап за третман на рак (Drost et al., 2017). Искористувањето на овие молекуларни карактеристики на туморите, како што се генетските, епигенетските и транскрипциските дефекти, за развој на лекови може да ги подобри клиничките исходи и да ги намали трошоците за скрининг. CRISPR е потенцијална алатка за уредување на гени која не само што може да открие и идентификува геномски цели што предизвикуваат рак, туку може да се користи и за уредување, супресија и епигенетски модифицирање на онкогените во човечките клетки (Табела 1) (Ahmed et al., 2021). Спроведени се неколку CRISPR скрининзи за да се бараат гени поврзани со супресори на тумори, онкогени и отпорност на лекови. Употребата на CRISPR/Cas9 за уредување на разни TNBC онкогени е прикажана на Слика 2.
Слика 2. Генско уредување на различни онкогени на TNBC со употреба на CRISPR/Cas9 што резултира со намален раст на туморот и метастази. Овие онкогени вклучуваат CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 и CXCR7, Crypto1, ROR1 и ST8SIA, кои се вклучени во појавата и метастазите на TNBC.
Миграцијата, инвазијата и епително-мезенхималната транзиција (EMT) на клетките на ракот се поврзани со ITGA9. Претходни студии покажаа дека ITGA9 е клучен играч во Notch патеката и игра интересна улога во метастазите на рабдомиосарком (Molist et al., 2020). Покрај тоа, беше откриено дека ITGA9 е тесно поврзан со прогнозата на пациентите кај неколку типови тумори, вклучувајќи го и ракот на дојка (Wang Z. et al., 2019). Покрај тоа, биоинформатичката анализа на ITGA9 покажа дека неговата експресија во TNBC е значително повисока отколку кај другите подтипови на рак на дојка. Зголемените нивоа на ITGA9 се поврзани со метастази на туморот и релапс кај пациенти со TNBC. Нокаутирањето на ITGA9 со CRISPR/Cas9 резултираше со својства слични на матични клетки на ракот (CSC), ангиогенеза на туморот, раст на туморот и намалена метастаза со промовирање на деградација на β-катенин во TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Крипто-1 е член на семејството TGF-β и е критичен за рана ембриогенеза, одржување на матични клетки и метастази на рак (Ishii et al., 2021). Исто така познат како Tdgf-1, тој е онкоген GPI-закотвен сигнален протеин вклучен во регулирањето на формирањето на примитивната лента, мезодермот и ендодермот, како и во воспоставувањето на лево/десна асиметрија во развојот на органите на телото за време на ембриогенезата (Zhang et al., 2021b). Дополнително, е покажано дека Cripto-1 е вклучен во епително-мезенхималната транзиција (EMT) како маркер на матични клетки (Zhang et al., 2021b). EMT е критичен не само за различни процеси како што се ембрионален развој, фиброза и заздравување на рани, туку и за инвазија на рак и метастази. Дополнително, е покажано дека Cripto-1 комуницира со четири Notch рецептори и го подобрува нивното пост-транслационо созревање (Brandstadter и Maillard, 2019). Познато е дека Notch сигналниот пат е вклучен во одржувањето на клетките на ракот на дојка кај луѓето. Студиите покажаа дека нокаутирањето на Crypto-1 со посредство на CRISPR/Cas9 го потиснува растот и метастазите на ракот. Затоа, Crypto-1 може да стане важна терапевтска цел за TNBC (Castro et al., 2015).
Протеинот XCL12 и неговиот хемокински рецептор CXC (CXCR4 и CXCR7) играат различни улоги во пролиферацијата, растот, миграцијата и инвазијата на клетките на ракот (Wu et al., 2015). Овие хеморецептори се поврзани со развојот на TNBC преку повеќекратни сигнални патишта и во in vivo и во in vitro модели (Wu et al., 2015). Покрај тоа, активирањето на CXCR4 и CXCR7 е поврзано со поголема подложност на метастази и лоша прогноза кај TNBC (Karn et al., 2022). Затоа, нокаутирањето на CXCR4 и CXCR7 може да стане ефективен гени-целни лекови за третман на рак на дојка, вклучувајќи го и TNBC. Студијата на Yang et al. Yang et al (2019) користела CRISPR/Cas9 за ко-нокаутирање на гените CXCR4 и CXCR7 и открила дека пролиферацијата, растот, миграцијата и инвазијата на TNBC се значително инхибирани (Yang et al., 2019).
Зголемени нивоа на miR-3662, онкоген на TNBC, беа забележани во ткивата на рак на дојка (Yi et al., 2022). Покажано е дека нокаутирањето на miR-3662 го инхибира растот и метастазите на тумор на рак на дојка и in vivo и in vitro (Agarwal and Gupta, 2021). HBP-1 е моќен инхибитор на Wnt/-катенин сигнализацијата и веројатно е одговорен за растот на TNBC клетките посредуван од miR-3662. Неодамна, Yi et al. открија дека оската miR-3662-HBP1 го регулира сигналниот пат Wnt/-катенин во TNBC клетките (Yi et al., 2022). Поради неговата специфична за туморот експресија, miR-3662 може да биде потенцијална терапевтска цел за TNBC. Така, CRISPR/Cas9-посредуваното нокаутирање на miR-3662 може да биде одличен пристап за развој на нови лекови за третман на TNBC.
UBR5 е нуклеофосфопротеин од 300 kDa кој е идентификуван како клучен регулатор на туморогенезата, метастазите и имунолошкиот одговор кај различни видови на рак (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Пријавено е дека UBR5 е многу зголемен во примероците од TNBC и ја стимулира функцијата на ERα со индуцирање на пролиферација преку неговата активност на убиквитин лигаза (Bolt et al., 2015). Студиите за секвенционирање на целиот екзом на примарни примероци од TNBC, исто така, покажаа зголемена експресија на UBR5, што укажува на неговата улога во развојот на TNBC. Дополнително, CRISPR/Cas9-управуваното бришење на UBR5 покажа значителна инхибиција на метастазите и растот на TNBC кај експериментални модели на глувци. Покрај тоа, вклучувањето на UBR5 во модел на глувци од див тип ја врати неговата целосна функционалност, додека овој ефект не беше забележан кај инактивирани мутантни соеви (Liao et al., 2017). Недостатокот на UBR5 е поврзан со зголемена апоптоза, некроза и инхибиција на растот на туморот кај TNBC поради слаба ангиогенеза. Поради губењето на UBR5, ширењето на туморот во далечните органи е намалено, а UBR5 индуцира абнормален EMT главно со намалување на експресијата на Е-кадерин (Zhang and Weinberg, 2018). Неодамна, се покажа дека UBR5 е многу важен фактор во транскрипцијата на PDL1 индуцирана од IFN-γ во TNBC поради недостаток на активност на убиквитинација на E3. Анализата на РНК транскриптомот покажа дека UBR5 може да има системски ефекти врз гените поврзани со патеката IFN-γ и да ја промовира трансактивацијата на PDL1 со зголемување на нивоата на активирање на протеин киназна РНК (PKR) и нејзините сигнални трансдуктори и активатори. транскрипција 1 (STAT1) и интерферон регулаторен фактор 1 (IRF1). Сепак, комбинираната аблација на експресијата на UBR5 и PD-L1 со посредство на CRISPR/Cas9 има синергистички терапевтски ефект од која било блокада поединечно, со длабоки ефекти врз микросредината на туморот (Wu et al., 2022). Така, CRISPR/Cas9 може да биде важна алатка за инхибирање на функцијата на UBR5, со што се сузбиваат метастазите на TNBC и растот на туморот.
ROR1 е трансмембрански протеин од тип I кој се експресира за време на ракот и ембрионалниот развој и е идентификуван како онкофетален протеин (Nicholas Borcherding, 2014). Инвазивното однесување на разни човечки видови на рак е поврзано со зголемена регулација на ROR1. Ветувачки резултати се добиени од in vivo и in vitro студии кои вклучуваат терапевтски соединенија насочени кон ROR1 (Chien et al., 2016). Зголемените нивоа на ROR1 mRNA во биопсиите на ткивото на дојката се поврзани и со агресивни базално слични тумори на дојката (BL) и нивна миграција во други делови од телото. Покрај тоа, прекумерната експресија на ROR1 е идентификувана како прогностички маркер за развој на TNBC (Chien et al., 2016). Сепак, замолчувањето на ROR1 со употреба на CRISPR/Cas9 за сузбивање на растот и метастазите на TNBC би била ефикасна стратегија.
Процесот на сијалилација вклучува додавање на сијална киселина во гликоконјугатите, што е катализирано од сијалилтрансферази (ST). ST8SIA1 припаѓа на семејството ST и игра важна улога во патогенезата на разни болести како што се лимфоцитна леукемија и колоректален карцином (Chang et al., 2018). Анализата на РНК секвенцата покажува дека ST8SIA1 е високо експресиран во ткивото на дојката кај пациенти со TNBC и е позитивно корелиран со мутации во генот за супресор на туморот p53, што може да придонесе за патогенезата на TNBC (Battula et al., 2017). Покрај тоа, ST8SIA1 е вклучен во метастазите и рекурентноста на TNBC, што сугерира дека игра важна улога во појавата и развојот на TNBC. Во in vitro модел на TNBC, беше покажано дека нокаутирањето на ST8SIA1 со CRIPSR/Cas9 го блокира растот и метастазите (Battula et al., 2017). Ова укажува дека CRISPR/Cas9 може да биде важна алатка за инхибирање на функцијата на онкогенот ST8SIA1 во третманот на TNBC.
NAT1 е метаболички ензим кој катализира формирање на ксенобиотски соединенија од фаза II и се експресира во речиси сите човечки ткива. NAT1 може да го користи кофакторот фолат за таргетирање на ацетил-CoA (ацетил-CoA) дури и во отсуство на ароматичниот амински супстрат (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Студиите покажаа дека NAT1 ја регулира функцијата на матрикс металопротеиназа 9 (MMP9) во моделите на клетки на рак на дојка и штити од реактивни кислородни видови (ROS) за време на гладување на гликоза (Wang et al., 2018). Докажано е дека бришењето на NAT1 го инхибира комплексот пируват дехидрогеназа, што доведува до митохондријална дисфункција (Wang L. et al., 2019). Дополнително, разни други извештаи покажаа дека инхибицијата на NAT1 со користење на мали молекули и замолчување на siRNA може да ја намали инвазивноста и пролиферацијата на клетките на рак на дојка (Stepp et al., 2018). Неодамна, CRISPR/Cas9 беше користен за сузбивање на NAT1 во клеточната линија MDA-MB-231 на рак на дојка, влијаејќи на клеточниот метаболизам во зависност од нивото на експресија. Оваа студија, исто така, покажа дека NAT-1 е клучен за прогресијата и метастазите на TNBC (Carlisle et al., 2020).
Координираната транскрипција на онкогените е регулирана од супер засилувачи, транскрипциски фактори и кофактори (Hnisz et al., 2015). Покрај тоа, група циклин-зависни кинази (CDK), како што се CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 и CDK13, се потребни за транскрипциска регулација. Меѓу нив, CDK7 е вклучена во фосфорилацијата на РНК полимераза II, што е многу важно за иницијацијата и проширувањето на онкогенската транскрипција во патогенезата на TNBC. Во една фундаментална студија, бришењето на CDK7 со CRISPR/Cas9 го инхибира TNBC, што укажува дека патогенезата на TNBC е зависна од CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Студиите покажаа дека мутациите во MYC и RBP (протеин што врзува РНК) можат да доведат до апоптоза, додека мутациите на еден ген во MYC или RBP не влијаат на растот на клетките на ракот (Einstein et al., 2021). Повеќе од 1000 RBP во човечкиот геном се скринирани со помош на библиотека базирана на CRISPR/Cas9. Меѓу нив, 57 RBP се покажаа како критични за растот на клетките на ракот со високо покачени нивоа на MYC (Wheeler et al., 2020). Покрај тоа, YTHDF2 е важен за одржување на растот на клетките на TNBC и ја намалува количината на метилирани транскрипти за време на транскрипција и транслација на високо ниво во клетките на ракот со повисока експресија на MYC. Дополнително, YTHDF2 не е неопходен за клетките на ракот, кои се помалку зависни од покачените нивоа на MYC за продолжување на преживувањето на пациентите со TNBC (Einstein et al., 2021), што укажува дека може да биде потенцијална терапевтска цел за лекови кои можат да го надминат TNBC.
Протеините на цинковите прсти (ZNF) сочинуваат приближно 1% од вкупниот човечки геном. Студиите покажаа дека ZNF може да ја регулира клеточната пролиферација кај различни видови на рак, како што се рак на црниот дроб, рак на дојка и колоректален рак (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Библиотеките генерирани со CRISPR нокаут се користат за скрининг на разни гени за супресија на тумори (TSG) во клетките на рак на дојка (Shalem et al., 2014). Оттогаш, транскриптомска студија на клетки на рак на дојка со избришан ZNF319 од CRISPR/Cas9 покажа дека ZNF319 е ген за супресија на тумори кој ја намалува пролиферацијата на рак на дојка и затоа е вклучен во различни потенцијални механизми за сигнализација и други биолошки функции (Wang L. et al., 2022).
Фероптозата е вид на програмирана клеточна смрт која зависи од присуството на железо. Познато е дека развојот на фероптоза е под влијание на присуството на липидни пероксиди. Покрај тоа, е објавено дека PKCβII покажува рана липидна пероксидација, а зголемената липидна пероксидација е поврзана со фероптоза. Скринингот на библиотека на CRISPR/Cas9-посредувани киназни инхибитори откри дека PKCβII е вклучен во процесот на липидна пероксидација, што е критично за фероптозата во клетките MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Затоа, ова сугерира дека нокаутирањето на PKCβII од CRISPR/Cas9 може да биде потенцијална цел на генот за супресор на туморот за третман на болести поврзани со фероптоза (Zhang et al., 2022).
Се верува дека отпорноста на лекови е одговорна за приближно 90% од смртните случаи кај пациенти со рак и е еден од главните предизвици во третманот на рак (Bukowski et al., 2020). Резултатите покажуваат дека доволен број гени поврзани со ефлукс на лекови, поправка на ДНК, апоптоза и разни патишта на клеточна сигнализација се поврзани со отпорност на лекови (Haider et al., 2020). Меѓу нив, неколку гени се таргетирани од алатките CRISPR/Cas9 и покажаа ветувачки резултати во намалувањето на отпорноста на лекови и зголемувањето на ефикасноста на третманите против рак (Vaghari-Tabari et al., 2022). Покрај тоа, библиотеките за скрининг на нокаут на гени CRISPR/Cas9 со висок проток се имплицирани во модифицирање на функцијата на потенцијалните цели на гените за отпорност на лекови (Shalem et al., 2015). За да се идентификуваат гени за резистенција на паклитаксел, секвенционирањето на РНК заедно со скрининг на sgRNA библиотеката на целиот геном беше искористено за да се идентификуваат осум кандидат гени, вклучувајќи ја и хистон деацетилаза 9 (HDAC9), кои се поврзани со резистенција на лекови кај пациенти со рекурентен TNBC (B et al., 2020). Во друга студија, зголемена експресија на дисерин/треонин и тирозин протеин киназа (DSTYK) беше забележана за време на преживувањето на пациенти со TNBC третирани со антиканцерогени лекови. Покрај тоа, CRISPR/Cas9-посредуваното нокаутирање на DSTYK значително ја зголеми апоптозата на клетките на ракот отпорни на лекови in vitro (SUM102PT клетки и MDA-MB-468 клетки) и in vivo TNBC модел (Ogbu et al., 2021).
Иако TNBC има абнормална активација на MAPK патеката, клиничкиот ефект на MEK-таргетираните терапии е слаб. CRISPR/Cas9 геномски скрининг откри дека инхибицијата на PSMG2 (шаперон 2 на склопување на протеом) ги сензибилизира TNBC BT549 и MB468 клетките кон MEK инхибиторот AZD6244. CRISPR/Cas9 нокаутирањето на PSMG2 ја промени нормалната функција на протеазомот, што доведе до автофагија-посредувано расклопување на PDPK1, со што дополнително се подобрија туморските клетки кај TNBC глувчешки модели индуцирани од AZD6244 (MEK инхибитор) и MG132 (инхибитор на протеазом). Така, протеазомските и MAP киназните (MEK) инхибитори можат да се администрираат синергистички за да се намали пролиферацијата на туморските клетки (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 е исто така користен за скрининг на губење на генската функција што доведува до отпорност на TNBC (Shu et al., 2020). Ge et al. го објаснија механизмот на отпорност на лекови на клетките на ракот третирани со JQ1, BET инхибитор на бромодомен (BBDI), кај TNBC. Користејќи CRISPR/Cas9, тие открија дека бришењето на генот rb1 предизвикува TNBC да стане отпорен на лекот против рак JQ1. Затоа, функцијата rb1 е важна во одговорот на JQ1 лековите кај TNBC. Тие исто така објавија дека паклитакселот е CDK4/6 киназа/инхибитор на микротубули, а неговата комбинација со BBDI како што е JQ1 може да обезбеди ветувачки терапевтски одговори на TNBC отпорни на лекови (Ge et al., 2020).
Транскрипцискиот пејзаж на долгата некодирана РНК (lncRNA) е објавен како одговорен за отпорност на неоадјувантна терапија кај TNBC. Оваа студија покажува дека пет различни транскрипти на MALAT1 lncRNA се високо експресирани во TNBC. Дополнително, CRISPR/Cas9-посредуваното бришење на MALAT1 ја зголеми чувствителноста на клетките BT-549 на TNBC кон паклитаксел и доксорубицин, што укажува на потенцијална улога на отпорноста на MALAT1 кај TNBC (Shaath et al., 2021).
Мутациите во BRCA1 (BRCA1m) се хетерогени и затоа тешки за откривање. Таргетирањето на PARP1 (поли(ADP-рибоза) полимераза), синтетичкиот летален партнер на BRCA1, може да ја зголеми хемосензитивноста на лековите на TNBC. Користејќи CRISPR/Cas9, бришењето на PARP1 ја зголеми чувствителноста на лековите против рак како што се доксорубицин, гемцитабин и доцетаксел кон клетките на TNBC мутирани од mBRCA1, што сугерира дека PARP1 е исто така вклучен во отпорноста на лекови кај TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Познато е дека мутациите во гените за супресор на туморот BRCA1 или BRCA2 ја зголемуваат веројатноста за развој на рак на дојка кај луѓето. Третманот на овие пациенти бара употреба на PARP инхибитори. Дополнително, покажано е дека нокаутирањето на факторот за спасување на нуклеотиди DNPH1 со употреба на CRISPR/Cas9 може да го отстрани токсичниот нуклеотид 5-хидроксиметилдеоксиуридин (hmdU) монофосфат, со што се подобрува одговорот на клетките со недостаток на BRCA на чувствителност на PARP инхибитори (Fugger). et al., 2021). Така, инхибиторите на CRISPR/Cas9 и PARP1 можат да станат важна стратегија за третман на TNBC.
Генот за пенетрантен гликопротеин (P-gp) е ген за мултирезистенција на лекови кој генерално е зголемен кај приближно 41% од сите TNBC (Sun et al., 2020). Ефлуксот на лекови предизвикан од P-gp е идентификуван како клучен регулатор на резистенцијата на лекови кај ракот на дојка. P-gp инхибиторите покажаа зголемена чувствителност на антиканцерогени лекови кај ракот на дојка (Famta et al., 2021). Така, CRISPR/Cas9-посредуваната аблација или супресија на P-gp и P-gp инхибиторите може да бидат многу важни методи за надминување на резистенцијата на лекови кај TNBC.
Познато е дека транспортерот на касети G2 што се врзува за ATP (ABCG2) предизвикува отпорност на лекови кај TNBC (Palasuberniam et al., 2015), иако во моментов нема извештаи за врската помеѓу замолчувањето на CRISPR/Cas9 и ABCG2 и инактивацијата на генот за супресор на туморот. PTEN може да ја зголеми активацијата на ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Затоа, употребата на CRISP/Ca9 за отстранување на ABCG2 и комбинирањето со инхибитор на ABCG2 може да биде соодветен третман за надминување на отпорноста на лекови кај TNBC. Табела 2 споменува CRISPR/Cas9 што ги таргетира сите гени за отпорност.
Табела 2. CRISPR/Cas9 ги таргетира различните гени за резистенција на TNBC за да ги сензибилизира клетките на лекови против рак.
CRISPR/Cas9 библиотеките се потенцијални алатки за скрининг на генски мутации поврзани со патогенезата на ракот (Chan et al., 2022). Овој метод на скрининг вклучува четири чекори како што се (а) изградба на библиотека, (б) лентивирусна трансдукција, (в) фенотипско скрининг и (г) анализа на целните гени. Иако TNBC има абнормална активација на MAPK патеката, клиничката прогноза на MEK целната терапија за пациенти со TNBC кои носат мутации во туморски супресорски гени како што се PTEN, RB1 и TP53 е многу лоша.
Дополнително, со скрининг за нокаут на гени со употреба на CRISPR/Cas9 беше тестиран најмоќниот и селективен молекул, дехидрокатрол, кој е во изобилство во екстрактите од цветови и лисја од Гватемала, за да се разбере ефектот на дехидрокатролот врз MDA-MB-231. Механизми на селективна цитотоксичност на клетките. Карактеристики на мезенхималното стебло на подтиповите на TNBC. Овој скрининг базиран на CRISPR/Cas9, исто така, откри дека HSD17B11, ген што кодира 17β-хидроксистероид дехидрогеназа тип 11, е високо експресиран во клетките MDA-MB-231 и резултира со дехидрофалкаринол специфичен за клетките MDA-MB-231 (Grant et. al., 2020). Така, ова сугерира дека геномскиот скрининг на CRISPR/Cas9 има голем потенцијал во идентификувањето на механизмите што лежат во основата на антиканцерогените својства на потенцијалните природни соединенија.
Дополнително, ранливоста на TNBC кон рак беше проучена со користење на непристрасен in vivo CRISPR/Cas9 скрининг на целиот геном, кој покажа врска помеѓу онкогените и туморските супресорски патишта. Клучните компоненти на mTOR и Hippo патиштата се објавени дека играат важна улога во регулирањето на туморот кај TNBC. Дополнително, студиите покажаа дека фармаколошката инхибиција на mTORC1/2 и YAP онкопротеинот ефикасно ја инхибира патогеноста на TNBC користејќи in vitro модел на синергија на лек-матрица и in vivo ксенографтови добиени од пациенти. Покрај тоа, инхибицијата на mTORC1/2 со посредство на Torin-1 ја зголемува макропиноцитозата, додека инхибицијата на YAP предизвикана од вертепорфин води до смрт на клетките на TNBC. Земени заедно, овие резултати ја истакнуваат моќта и робусноста на in vivo CRISPR скринингот на целиот геном за да се идентификуваат нови и ефикасни третмани за TNBC (Dai et al., 2021).
Дисрегулацијата на имунолошкиот систем е важен фактор во туморогенезата. Клетките на ракот го избегнуваат имунолошкиот чистка со заобиколување на одбранбените механизми, вклучително и мешање во активноста на имуните клетки во микросредината на туморот и компромитирање на имунолошкиот систем. Затоа, развојот на подобрен имунолошки систем може да биде клучен пристап во борбата против туморите. Употребата на модификација на гени базирана на CRISPR/Cas9 се справува со неколку прашања поврзани со имунолошката дисфункција од различни перспективи. CRISPR/Cas9 се користи за подобрување на антитуморскиот имунитет против ракот на дојка преку следниве патишта (Слика 3).
Слика 3. CRISPR/Cas9 имунотерапијата ги таргетира TNBC клетките. Губењето на CDK5 и нокаутирањето на PDL1 и CD155 го зајакнуваат имунолошкиот систем. Слично на тоа, губењето на A2AR и нокаутирањето на TAA како што се HER2, муцин 1 и TEM8 ја зголеми ефикасноста на CAR-T клетките во убивањето на клетките на ракот. Скринингот на Т-клетки управуван од CRISPR/Cas9 покажа дека нарушувањето на p38 киназата ја зголемува антитуморската активност на Т-клетките. Т-клетките модифицирани со CRISPR/Cas9 ја зголемуваат експресијата на TCR (Т-клеточен рецептор), што резултира со Т-клетки кои имаат антитуморска активност.
Целта на имунотерапијата е да се стимулира имунолошкиот систем да ги нападне клетките на ракот. Прекумерната експресија на имунолошките протеини на контролните точки обично ги спречува автоимуните реакции, но може да им помогне на раковите да ги избегнат (Topalian et al., 2015). Овие протеини ги спречуваат имунолошките реакции со врзување за рецепторите на површината на имуните клетки. Повеќе протеини на контролните точки (како што се CD155 и PD-L1) го таргетираат PD-1 рецепторот на имуните клетки и се експресираат кај ракот на дојка, особено кај TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Нокаутирањето на PD-L1 или неговиот рецептор со употреба на CRISPR/Cas9 може да го стимулира имунолошкиот систем да ги нападне туморите на TNBC (Yahata et al., 2019). Дополнително, намалената регулација на експресијата на PD-L1 преку бришење на CDK5 посредувано од CRISPR/Cas9 е покажано дека го инхибира растот на туморот in vitro и in vivo (Deng et al., 2020). Инхибицијата на растот кај in vitro и in vivo модели на рак на дојка сугерира дека намалувањето на CD155 посредувано од shRNA може да има терапевтски ефект врз ракот на дојка (Gao et al., 2018).
CAR Т-клетките експресираат CAR кои препознаваат антигени поврзани со тумор (TAA) и можат да користат нокаутирање на протеините на контролните точки за да ја зголемат својата активност (Li C. et al., 2020). Постојат различни потенцијални цели за терапија со CAR Т-клетки кај рак на дојка, вклучувајќи неколку TAA како што се HER2, муцин1 и TEM8 (Bajgain et al., 2018). Постојат докази дека CAR Т-клетките кои го таргетираат мезотелинот (преекспресиран во TNBC BT-459 клетките) се поефикасни против ракот кога PD-1 е нокаутиран со употреба на CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Сепак, изолирањето на Т-клетките од пациентите, а потоа нивното уредување ex vivo е процес кој бара многу труд и време. Иако универзалните Т-клетки можат да ги намалат барањата за изолација, донорските Т-клетки кои експресираат човечки леукоцитен антиген (HLA) класа I и Т-клеточен рецептор (TCR) треба да се отстранат за да се спречат абнормалности на графт наспроти домаќин (Ren et al., 2017). , 2017a). Користејќи CRISPR/Cas9, HDR може истовремено да ги елиминира TCR и HLA и да го нокаутира генот што го кодира CAR. Студиите покажаа дека CRISPR/Cas9 може да се користи за воведување на анти-CD19 CAR во локусот на TCR, со што ефикасно се произведуваат CAR без да се осиромашат Т-клетките (Dimitri et al., 2022). Развиени се мултиплекс технологии за генерирање на алогени CAR Т-клетки со истовремено елиминирање на TCR, бета-2-микроглобулин (B2M), HLA-I подгрупа и други протеини како што се PD-1 и CTLA-4, кои можат да имаат поголеми антиканцерогени својства против TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Користењето на CRISPR/Cas9 може да ја подобри ефикасноста на CAR-T клетките. Познато е дека аденозинот има имуносупресивни својства и може да го намали имунитетот против рак со блокирање на функцијата на Т-клетките и активирање на аденозинските A2A рецептори (A2AR) (Vigano et al., 2019). Замолчувањето на A2AR со употреба на CRISPR/Cas9 значително ја подобри ефикасноста на CAR-T клетките in vivo (Giuffrida et al., 2021). Познато е дека Т-клетките покажуваат различни фенотипски карактеристики како што се клеточна експанзија, диференцијација, оксидативен стрес и геномски стрес. Скринингот на Т-клетките базиран на CRISPR/Cas9 откри нарушување на 25 различни кинази на рецепторот на Т-клетките. Меѓу нив, покажано е дека бришењето на p38 киназата ја зголемува антитуморската активност на Т-клетките, што укажува дека p38 киназата е клучен регулатор на регулацијата на CAR-T клетките (Gurusamy et al., 2020).
Т-клетките можат да бидат генетски модифицирани со помош на CRISPR/Cas9 за да се произведат високо експресирани TCR. Трансферот на генетски модифицирани Т-клетки кај пациенти покажа посилна антиканцерогена активност од ендогените Т-клетки. Затоа, ендогените TCR можат да се натпреваруваат со генетски изменетите TCR кај пациентите, што може да влијае на потенцијалот на имунотерапијата против рак. За да се надмине овој проблем, користењето на CRISPR/Cas9 за отстранување на ендогени TCR-β во клетките приматели и последователно пренесување на TCR-β Т-клетки кај пациенти со рак може да покаже подобри антиканцерогени имунолошки одговори без потреба од ендогена сексуална конкуренција на TCR (Fan et al. 2018). Така, со исклучок на CRISPR-модифицираните Т-клетки, TCR се илјада пати почувствителни на туморски антигени од нормалните TCR-трансдуцирани Т-клетки. Дополнително, кај разни леукемии, изменетите Т-клетки генерирани од γδ TCR+ CRISPR покажуваат поголема експресија на CD4+ и CD8+ Т-клетки од стандардниот TCR трансфер (Legut et al., 2018). Така, модифицираните Т-клетки генерирани од CRISPR/Cas9 можат да бидат ефикасен метод на имунотерапија за надминување на TNBC.
Интегрините се молекули за адхезија на клетките кои се присутни во клеточните трансмембрани и го поттикнуваат врзувањето на клетките за екстрацелуларниот матрикс (ECM) (Hamidi and Ivaska, 2018). Дисрегулацијата на интегрините е поврзана со развојот и миграцијата на ракот преку менување на екстрацелуларниот матрикс, што доведува до преживување на клетките на ракот во циркулацијата (Hamidi and Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9-посредуваното нокаутирање на интегринот ја забавува прогресијата на туморот, метастазите и колонизацијата кај TNBC. Објавено е дека нокаутирањето на интегрин a5 (ITGA5) ја намалува миграцијата и прогресијата на клетките кај други видови на рак, како што е ракот на белите дробови (Ju et al., 2017), што укажува дека интегрин a5 може да биде и клучен фактор во патогенезата на TNBC.
Генерирањето на нокаут глувци со употреба на традиционални методи на ембрионални матични (ES) клетки е процес кој бара многу труд, одзема многу време и е неефикасен. Потребни се месеци и години за да се таргетираат ES клетките преку хомологна рекомбинација, да се размножат химерни глувци, а потоа да се вкрстат со хетерозиготни глувци за да се произведе хомозиготно потомство. Потребно е комплексно вкрстување за да се создадат глувци со повеќекратни генетски мутации. Сепак, се појавија многу проблеми при употреба на глувци генерирани со аблација на ES клетки со употреба на CRISPR/Cas9 или со микроинјектирање на компоненти на CRISPR/Cas9 во едноклеточни оплодени јајца. На пример, воведувањето на промени често се случува на биалелни локуси и не е ген-специфично. Неодамна беше објавено дека ES клетките што користат CRISPR/Cas9 технологија можат истовремено да вметнат биалелни мутации во до 5 гени (Nishizono et al., 2021). За таа цел, Cas9 mRNA и пет ген-специфични gRNA беа истовремено трансфектирани во ES клетки. Ова го истакнува ветувањето и ефикасноста на оваа постапка, иако овие мутации можеби се пренеле кога основачките линии биле одгледувани за да се произведат петкратни нокаут глувци. Студијата, исто така, објавува изненадувачко откритие: ES клетките повеќе не се потребни за создавање генетски модифицирани глувци. Наместо тоа, за отстранување на специфични генски производи, Cas9 mRNA и gRNA биле инјектирани во ембриони во фаза на една клетка. Како резултат на тоа, создадени се нокаут основачки линии кои теоретски можат да се користат за проучување на последиците од бришењето на гени кај глувци (Qin et al., 2016). Така, CRISPR/Cas9 овозможува создавање трансгени глувци за лекување на TNBC по пониска цена од традиционалниот генетски инженеринг. Користејќи го системот CRISPR/Cas, развиен е нов модел на нокаут глувци кој може успешно да воведе точкести мутации во еден или повеќе ендогени гени во TNBC. Врз основа на овој концепт, животинските модели на TNBC можат да се развијат и со користење на CRISPR/Cas9-посредувано делеција на BRCA1 и p53, што резултира со губење на поправката на HR, геномска нестабилност и мутантни фенотипови (Annunziato et al., 2020).
Во моментов, за дијагностицирање на TNBC се користат различни методи како што се мамографија, магнетна резонанца (МРИ) и ултразвук. Сепак, овие методи имаат некои ограничувања. Мамографијата се користи за дијагностицирање на локално ткиво на дојка, а не метастази, каде што клетките на ракот мигрирале во други органи. Ултрасонографијата не е сигурен метод за дијагностицирање на TNBC (Chen and Lee-Felker, 2023). МРИ има поголема чувствителност од ултразвукот и мамографијата, но нејзината дијагностичка точност е ограничена (Sha and Chen, 2022). Биопсијата на ткивото е инвазивен начин за идентификување на клетките на ракот. Сепак, во некои случаи, биопсијата може да го пропушти канцерогеното ткиво ако иглата се оддалечи од областа на интерес. Покрај тоа, таа е многу скапа и може да биде трауматична за пациентот. TNBC е хетероген вид на рак, па затоа биопсијата може да не обезбеди доволно информации за видот на рак. Затоа, итно е потребен нов дијагностички сигурен метод за откривање на TNBC. CRISPR/Cas9 може да послужи како високо чувствителна и минимално инвазивна алтернатива за дијагностицирање на рак на дојка. За таа цел, стратегиите базирани на CRISPR/Cas9 можат да се користат за подобрување на PCR методите за дијагностицирање на TNBC. Прво, протеините Cas9 и cpf1 од CRISPR системот се користат за отстранување на неспецифична ДНК, а потоа овие два протеини (Cas9 и cpf1) можат да ја препознаат PAM секвенцата пред да се врзат за целната ДНК (Deepak Singh et al., 2021). Така, PCR може да идентификува мутации поврзани со развој на рак. Неколку студии ја усвоија оваа стратегија базирана на CRISPR за откривање на различни мутации кај различни видови на рак (Safari et al., 2019). Така, PCR методите базирани на CRISPR можат да ја намалат зависноста на дијагнозата на TNBC од инвазивни методи како што е имунохистохемијата базирана на биопсија.
Генотипски промени во регулацијата на хормонските рецептори се исто така демонстрирани кај TNBC (Chen and Russo, 2009). PCR стратегиите базирани на CRISPR/Cas9 со употреба на микрочипови за дијагностика на местата на грижа можат ефикасно да ги следат овие мутации (Hajian et al., 2019). Исто така, би можеле да им обезбедат на здравствените работници релевантни информации за специфични мутации кај пациенти со TNBC, што би можело да помогне во подобрувањето на нивниот тек на лекување. Сепак, оваа комбинирана техника има ограничувања. Затоа, потребни се обемни истражувачки напори пред овој CRISPR/Cas-PCR метод да може да се користи во здравството за дијагноза на TNBC (Yang et al., 2019).
Време на објавување: 14 октомври 2024 година